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电子克隆的应用 组员： 吴欢欢、潘梅萍、唐玲、赵利南、郭平强、曾金镇、李培晖、滕瑜、张研 前言 介于前一组同学很系统的介绍了电子克隆的内容；所以，我们组在此通过讲解文献的方式，针对电子克隆在植物、动物、人类上的应用，对电子克隆的内容做个拓展补充。 电子克隆在植物方面的应用 电子克隆在动物方面的应用 电子克隆在人类方面的应用 content 一、电子克隆在植物方面的应用 电子克隆概念： 电子克隆( in silicon cloning) 是近年来伴随着基因组计划和 EST ( 表达序列标签 expressed sequence tags) 计划发展起来的基因克隆新方法, 主要原理是利用日益发展的生物信息学技术, 借助电子计算机的巨大运算能力, 通过EST 或基因组的序列组装和拼接, 进一步利用 RT-PCR 的方法快速克隆功能基因。 基因克隆的传统方法主要是图位克隆和转座子标签法克隆等, 但这些方法操作技术复杂, 成本高, 实验周期长, 在基因克隆中并没有能得到非常广泛的运用。 最近发展起来的mRNA 差异显示技术、抑制差减杂交技术和基因表达系列分析技术由于其操作相对简便、效率高, 已成为功能基因克隆的重要手段, 在许多实验室得到应用, 但其主要缺点是 得到的 cDNA 都不是全长cDNA, 必须通过cDNA 文库筛选或 RACE 的方法才能获得全长cDNA, 进一步用于基因的功能分析和转基因研究。 植物方面：以水稻为例 水稻是我国重要的粮食作物, 挖掘和克隆水稻功能基因是利用基因工程技术进行水稻品种改良、有效利用基因资源的基础。 植物方面：以水稻为例 水稻功能基因电子克隆的方法[1] 1、利用 EST 数据库信息进行功能基因的电子克隆是目前最常用的手段, 其实验流程见图1： 首先选择感兴趣的水稻 EST 作为查询探针, 搜索水稻dbEST 数据库, 找到部分重叠的EST 进行拼接, 然后再以拼接好的 EST 重叠群( EST contig) 为新的查询探针, 继续搜索dbEST 库, 直到没有新的EST可供拼接为止, 最后根据拼接好的完整序列设计PCR引物, 通过RT-PCR的方法获得目的cDNA 克隆并进行序列测定验证。 图1 植物方面：以水稻为例 2、利用基因组信息 利用基因组信息资料进行电子克隆的最大优点就是基因的克隆不受作物发育时期或特殊环境条件的限制,可以用来源于任何时期或组织的水稻和其他物种的EST 或全长 cDNA 序列作为信息探针搜索位于GenBank 或者我国华大公布的水稻基因组序列, 随后根据内含子“GU. . .AG”的规则通过人工拼接或相应的计算机软件预测, 可以得到该基因完整的开放读码框(ORF) , 根据拼接的序列结果设计PCR引物, 进一步采取 RT -PCR 的方法获得目的基因的cDNA 克隆并进行序列测定, 具体实验流程见图 1。 植物方面：以水稻为例 由于水稻的序列框架图刚刚公布, 目前利用基因组序列进行水稻功能基因克隆还未见报道。利用来自小麦的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶cDNA 克隆T agpd1 序列为探针, 搜索水稻基因组数据库, 结果找到 1 个与之高度同源的水稻相应基因组BAC 序列, 通过人工序列拼接和 RT-PCR 首次克隆到了水稻葡萄糖-6-磷酸脱 氢酶的全 长 cDNA, 命名 为OsG6PDH ( GenBank 注册号: AY078072) , 经分析表明该基因编码的蛋白为胞质G6PDH, 是磷酸戊糖途径的限速酶。 电子克隆往往是结合以上两个方面即EST 数据库和基因组信息资料同时进行的。因为EST 数据直接代表的是表达序列, 所以在电子克隆的拼接中占有非常重要的地位。一般策略是对于任何一个感兴趣的序列首先进行 EST 拼接, 无法继续拼接后再进行基因组比较和外显子预测, 以判断EST 拼接的完整性。当然序列拼接只是在计算机上的“虚拟克隆”, 还需要通过RT-PCR、序列测定和Northern 杂交等方法进行验证和基因表达水平的鉴定。 植物方面：以水稻为例 3、电子克隆中的一些常见问题和对策 电子克隆虽然在执行速度上有很大的优势, 但在实际应用中常常会碰到一些非常棘手的问题, 针对这些问题, 列出了以下解决方案。 　　　 ( 1) 有时难以获得完整的 5 端序列。这是电子克隆中遇到的最主要问题。因为植物基因的 5 端保守性一般比较低, 在以基因组序列为基础的电子克隆中尤其难以确定。根据 Kozak 规则以及我们的经验, 对于完整ORF 的5 的完整性一般有以下几条原则: 植物方面：以水稻为例 A:参考 5 端的起始密码子 AUG 的周围序列( GCC) GCCA/ GCCAUGG 规则; B: 在起始密码子上游的同阅读框序