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中文摘要 人牙周膜细胞与牙龈成纤维细胞生物学活性 的实验研究 摘 要 目的：牙周组织包括牙龈、牙周膜及矿化组织牙骨质和 牙槽骨，主要作用是支持稳固牙齿。由于其组成的多样性， 使牙周组织愈合比一般的软组织愈合更为复杂。成纤维细胞 是牙龈结缔组织和牙周膜的主要细胞类型，在牙周组织的形 成与再生、完整性的维持及功能的实施中起重要作用。有研 究认为牙周膜细胞(periodontalligament 龈成纤维细胞(gingival 电镜下观察其在形态上没有区别，但在功能上具有明显的差 异：牙龈成纤维细胞主要与牙龈组织的自身稳定有关，而牙 周膜细胞除维持自身的稳定外，还可分化成成骨细胞和成牙 骨质细胞参与邻近牙槽骨和牙骨质的改建及修复再生。目前 尚缺乏明确的区别牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞的细胞标 志物。 牙周病是人类常见病、多发病，发病率高达80％以上。 患病后常导致牙周组织结构破坏。牙周附着丧失、牙周袋形 成、牙齿松动甚至脱落，是导致成年人失牙的主要原因。牙 周病手术治疗后，牙周组织的愈合趋向于牙周各种细胞成分 的竞争性生长，只有牙周膜细胞首先占据牙根面，才能形成 真正意义的牙周组织再生：将体外培养的牙周膜细胞和牙龈 成纤维细胞植入动物体内，发现牙龈成纤维细胞不能形成新 的牙周再生所需的各种组织，多为纤维性愈合，而牙周膜细 中文摘要 胞则可形成再生性愈合。 本实验采用体外原代培养人牙周膜细胞和牙龈成纤维 细胞，四唑盐比色法(MTT)比较二者的增殖特性、检测碱 性磷酸酶(Alkaline 法对比两种细胞对于I、Ⅲ型胶原、骨形成蛋白(bone morphogenetic 研究牙周组织中各种细胞的生物学特性、进一步找出牙龈成 纤维细胞和牙周膜细胞的鉴别标志提供理论基础，并为今后 改良两种细胞使其成为牙周组织工程的理想种子细胞奠定 基础。 方法：采用组织块法分离培养牙周膜细胞和牙龈成纤维 细胞，测定二者的增殖特性和ALP活性。利用免疫组化和 FCM方法比较I、Ⅲ型胶原、BMP的表达情况，以观察对 比两种细胞的生物学特性的异同。 1原代培养及传代 体外人牙周膜细胞原代培养：取临床上12岁左右因正畸 需要拔除的健康前磨牙，刮取牙根中1／3的牙周膜组织，利用 组织块法培养牙周膜细胞，当细胞生长至铺满瓶底80％时进 行传代。取第二代细胞爬片，鉴定细胞来源。 体外人牙龈成纤维细胞原代培养：取同一个体同一部位 的龈乳头组织，按上述相同方法进行牙龈成纤维细胞培养。 2增殖活性的比较 取第四代牙周膜细胞与牙龈成纤维细胞，以2×104／ml modified d，分别于第3、5、7 eaglemedium)培养基共培养7 中文摘要 nm波长 d，各取出一个96孔板，MTT法于酶标仪上492 读取A值。 3ALP活性比较 取第五代牙周膜细胞与牙龈成纤维细胞，以1×105／ml 的细胞浓度接种于24孔培养板，10％DMEM培养基共培养 7d，弃孔内液体，加入TritonX-100，4C过夜，进行如下实 验：取上述各孔液体及空白对照的蒸馏水一并转入另一96 孔板。按ALP试剂盒说明依次按比例加入缓冲液、基质液， 水浴，加入显色剂后在酶标仪上于410nnl波长下测得OD 值，间接反映细胞ALP活性。 4免疫组化染色 取第五、六代牙周膜细胞与牙龈成纤维细胞，以2X 培养板中，加入10％DMEM培养基培养一周，95％乙醇固 定后进行免疫组化染色，光学显微镜下观察。 结果判定：细胞胞浆中有棕色颗粒为阳性。以染色强度 为判定标准，分为四级：无棕色颗粒记为(一)；仅有少量、 细小、散在的棕色颗粒，着色较浅，记为(+)；棕色颗粒 聚集成大颗粒记为(++)；颗粒密集成团片状，着色深棕， 记为(+++)。 5流式细胞学检测 取第六代牙周膜细胞与牙龈成纤维