引物设计及测序结果分析要点.pptVIP

引物（primer）是一段短的单链DNA或RNA片段，可结合在DNA模板链上与之互补的区域，作为DNA复制的起始点。 体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR )、测序和探针合成等。 引物设计是PCR技术中至关重要的一环，其优劣直接关系到PCR的特异性和实验能否成功。 三步循环：变性、退火、延伸?? 1.变性：双链DNA解链成为单链DNA?? 2.退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合 3.延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链 引物与模板的序列要紧密互补 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体(dimer)或发夹结构(hairpin) 引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配) 1、引物的长度 一般15～30bp，常用18～24 bp。 引物过短容易引起错配现象，引物过长会导致PCR延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶。 ?G 值是指DNA双链形成所需的自由能，反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。 3 ‘端?G 值应较低，否则易引起错配。 7、引物的GC含量 G+C含量以40-60%为宜。 G+C太少，PCR扩增效果不佳；G+C过多，易出现非特异条带。 9、引物的修饰情况 引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。 引物5′ 端修饰包括：加酶切位点、标记生物素、荧光、地高辛等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。 在计算Tm值时不必考虑附加序列，但在检测互补及二级结构时要加上它们。 常用引物设计软件： Primer Premier 5.0 Primer 3 DNAman Oligo 6（引物评估软件） /nuccore/NC_003495.1 /nuccorefrom=455to=3511 /nuccorereport=fastafrom=455to=3511 将查找到的CDS序列以.txt文件保存 将查找到的CDS序列以.seq文件保存 （二）序列同源性比较1、利用在线的NCBI中的BLAST工具进行比较2、利用DNAman等软件进行多序列比较 序列比对结果 引物搜索选项设定 搜索结果 引物设计窗口 引物数据的保存 （三）引物设计与筛选 Load sequence 1、利用Primer Premier 5.0 软件设计引物，扩增BPMV CP基因片段。 Primer Premier 启动界面 Press OK 导入已知的BPMV CP基因的CDS(coding sequence)序列 note：存储的文件路径及名称不能含有中文。 序列导入结果显示窗口 在目的序列的第一个碱基处双击 Genbank窗口 点击“primer”按钮 点击“search”按钮 Press “OK” Press “OK” 点击选中一对引物 搜索结果窗口 （primer design） 3.1 引物设计 引物的定义 DNA模板 95℃（解链） 60℃（退火）与引物结合 72℃（延伸） DNA单链 Taq酶，dNTPs, Mg2+ Forward primer Reverse primer PCR的基本原理 GTGATGTTCCTGACGGTACTC TAAAGTCACCGTGGACGGACC 5? 3? 5? CACTACAAGGACTGCCATGAG TAAAGTCACCGTGGACGGACC 5? Reverse primer/anti-sense primer : 5? CCAGGCAGGTGCCACTGAAAT Forward primer/sense primer: 5? CACTACAAGGACTGCCATGAG CACTACAAGGACTGCCATGAG ATTTCAGTGGCACCTGCCTGG 5? 3? PCR Rrimers MⅡ 500bp 700bp 900bp 1200bp 61 63 65 NC 100bp 300bp 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物（1） 5′···GCAGTACATGTC ···3′ 3′··· c g t c a t g t a c a g ···5′ 编码链(CDS) 模板链 mRNA 5′···GCAGUACAUGUC ···3′ 转录 N······Ala · Val · His · Val ······C 蛋白质 翻译 DNA模板链、编码链与转录及翻译的关系 反转录 CDS（coding sequence）是编码一段蛋白产物的DNA序列。一般以AT