载BMP2质粒NA的壳聚糖温敏水凝胶对牙周膜成纤维细胞相容性的评价.pdfVIP

摘 要 目的：本项目拟制备物理交联壳聚糖-甘油磷酸温敏水凝胶（CS/α,β-GP ）负 载含有骨形态发生蛋白2质粒DNA 的壳聚糖纳米粒CSn(pDNA-BMP2)，将其 与CS/α,β-GP 温敏水凝胶复合，构建CS/CSn （pDNA-BMP2）-GP复合修复 体系。研究该体系对人牙周成纤维细胞（HPDLCs）的细胞相容性。 方法：一、载BMP2质粒DNA 的壳聚糖纳米粒(CSn(pDNA-BMP2))的制备及 性质检测：成功构建pDNA-BMP2 质粒表达载体；采用离子交联法制备载 BMP2质粒DNA壳聚糖纳米粒CSn （pDNA-BMP2）；采用扫描电镜观察形 态；zeta 电位仪测定粒径、分散度、Zeta 电位；应用琼脂凝胶阻滞法分析CSn 载体与pDNA-BMP2 的结合能力及电荷性质；运用酶保护法测定CSn载体对 pDNA-BMP2 的保护作用。二、CS/CSn （pDNA-BMP2）-GP体系的构建及性 质检测：（1）CS/α,β-GP 温敏水凝胶的制备：采用物理交联的方法制备 CS/α,β-GP 温敏水凝胶；扫描电镜下观察其微观形态；试管倒置法测定其温敏 性。（2）CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP体系的构建：取适量的CSn（pDNA-BMP2） 磁力搅拌下分散于CS/α,β-GP温敏水凝胶溶液中，构建载CSn（pDNA-BMP2） 的CS/α,β-GP温敏水凝胶体系，即CS/CSn （pDNA-BMP2）-GP复合体系；扫 描电镜下观察其微观形态；试管倒置法测定其温敏性。三、CS/CSn （pDNA-BMP2）-GP对HPDLCs细胞相容性的评价：（1）原代培养HPDLCs， 并鉴定组织来源。（2）HPDLCs在CS/CSn （pDNA-BMP2）-GP复合体系中 三维培养，观察细胞形态及增殖情况。（3）将HPDLCs在CS/CSn（pDNA-BMP2） -GP复合体系浸提液中培养，CCK8法检测细胞增殖情况；采用SPSS18.0统 计软件处理所得数据。 结果：一、CSn(pDNA-BMP2)的制备及性质检测结果：（1）空白CSn及 CSn(pDNA-BMP2)电镜下观察，呈球形，粒径均一；CSn(pDNA-BMP2)粒径 较空白CSn略大。（2）CSn 的平均粒径为170nm，PDI为0.249，Zeta 电位 为45.5mv。CSn(pDNA-BMP2)平均粒径为270.1nm，PDI为0.486，Zeta 电位 为27.0mv。 （3）琼脂凝胶电泳分析显示，由于中和了质粒DNA所带的负电 荷，电泳时质粒不出孔，而裸质粒pDNA-BMP2 出孔，证明CSn能有效地结 合pDNA-BMP2； （4）酶保护实验显示，裸质粒pDNA-BMP2及N/P 为0.5： 1的孔内显示空白无条带，而CSn(pDNA-BMP2)在N/P为1：1、1.5：1、2： 1、2.5：1时，则仍为白色。证明CSn(pDNA-BMP2)在N/P为1：1、1.5：1、 2：1、2.5：1时，可以有效保护pDNA-BMP2 免受酶的降解。二、CS/CSn （pDNA-BMP2）-GP复合体系的构建及性质检测结果：（1）试管倒置法显 示CS/CSn （pDNA-BMP2）-GP复合体系均可在37℃下3min 内由可流动的 溶胶状态转变为不可流动的凝胶状态； （2）扫描电镜显示，复合体系为多孔 的交联网状结构且CSn （pDNA-BMP2）能均匀分散于水凝胶支架的三维网状 结构中。三、CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP对HPDLCs细胞相容性的评价结果： （1）成功原代培养HPDLCs，免疫组织化学结果显示，培养的细胞HPDLCs 波形丝蛋白染色阳性，角蛋白染色阴性，证明细胞来源于外胚层。 （2）结晶 紫染色显示，HPDLCs在CS/CSn （pDNA-BMP2）-GP复合体系中形态良好， 48h后开始扩增。（3）CCK8实验结果显示，不同浓度的CS/CSn（pDNA-BMP2） -GP温敏水凝胶复合体系浸提液在 1d和3d 时均能促进HPDLCs 的增殖，且 CS/CSn （pDNA-BMP2）-GP温敏水凝胶复合体系浸提液培养的HPDLCs较 CS-α,β-GP温敏水凝胶浸提液培养的的细胞增殖更快。 结论： （1）CSn具有良好的形态、粒径及电位。 （2）CSn能有效结合和保护pDNA-BMP2，CS/CSn （pDNA-BMP2)在 N/P为2.5:1 时具有最好的形态、粒径及电位。 （3）CS/CSn （pDNA-B