细胞生物学第二章细胞生物学实验技术课件.ppt

对细胞生命活动的研究成为当今生命科学发展的瓶颈 电子显微镜的基本构造 电镜与光镜的比较 电镜与光镜光路图比较 电镜三维重构技术 电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的 具有重要应用前景的一门新技术。 电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振 分析技术相结合，是当前结构生物学（Structural Biology） ——主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。 特异蛋白抗原的定位与定性 ?免疫荧光技术： 快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限 。 ?蛋白电泳(SDS) 与免疫印迹反应(Western-Blot) ?免疫电镜技术： ?免疫铁蛋白技术 ?免疫酶标技术 ?免疫胶体金技术 应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 表三、实验室中常用的几种细胞系 细胞系名称 细胞类型 来源 3T3 成纤维细胞 小鼠 HeLa 宫颈癌上皮细胞 Henrietta Lacks BHK21 成纤维细胞 叙利亚仓鼠 PtKl 上皮细胞 袋鼠 L6 成肌细胞 大鼠 PCI2 嗜铬细胞 大鼠 SP2 浆细胞 小鼠 SP2／0 骨髓瘤浆细胞 小鼠 CHO 卵巢细胞 中国地鼠 Henrietta Lacks, American black ,died of cancer of uterine cervix in 1951 Hela细胞（左）、CHO细胞（右）的培养 （二）植物细胞培养 外植体培养：诱发产生愈伤组织。用于研究植物的生长发育、分化和变异；进行无性繁殖；制取代谢产物。 悬浮细胞培养：在愈伤组织培养技术基础上发展起来的一种培养技术。适合于进行产业化大规模细胞培养，制取植物代谢产物。 原生质体培养：培养脱壁后的细胞，特点： ①比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA； ②便于进行细胞融合，形成杂交细胞； ③适宜条件下可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。 单倍体培养：通过花药或花粉培养可获得单倍体植株。 Plant Cell Culture Animal Cell Culture 二、细胞融合 通过培养和介导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cell fusion）或细胞杂交。 同核体：相同基因型的细胞融合而成。 异核体：不同基因型的细胞融合而成。 自发融合：同种细胞在培养过程中自发合并的现象。 诱发融合：异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合。 诱导细胞融合的方法：生物方法（仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒 ）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（电击和激光）。 HAT:hypoxanthine，aminopterin，thymidine 单克隆抗体技术 B淋巴细胞能分泌特异抗体，但不能长期培养，瘤细胞可以在体外长期培养，但不分泌特异抗体。于是Kohler和Milstein 1975将两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术，获1984年诺贝尔奖。 几种模式生物 Caenorhabditis elegans Drosophila melanogaster Arabidopsis thaliana * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 显微操作仪 转基因显微操作过程 第二节 生物化学与分子生物学技术 一、细胞化学技术 组织化学和细胞化学染色方法用于对某些细胞成分进行定性和定位研究。 （一）固定 物理固定：血膜空气干燥、冷冻干燥。 化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等试剂。显示多糖常用乙醇固定，显示酶类多用甲醛丙酮缓冲液固定。 （二）显示方法 金属沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。 Schiff反应：醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）。 联苯胺反应：过氧化酶分解H202。产生新生氧，后者再将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。 脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。 茚三酮反应：显示蛋白质。 二、免疫细胞化学 immunocytochemistry 是利用抗体同特定抗原专一结合的原理，对抗原进行定位测定的技术。常用的标记物有荧光素和酶。 免疫荧光法（immunofluorescent technique）：如异硫氰酸荧光素、罗丹明等。 酶标免疫法（enzyme-label