Arreste蛋白的表达纯化工艺及药效学研究.pdf

Arresten蛋白的表达纯化工艺及药效学研究 摘要 目的： 1．建立斯eSten蛋白的JMl09／pBV22l／A鹏stcn原核表达体系； 2．研究加TeSten蛋白的纯化方法，建立Arrestcn蛋白的制备工艺； 3．A玳sten蛋白纯品的药效学研究。 方法： 1．内源性血管生成抑制因子Arl．郫ten原核表达体系的建立 I双酶切，将加他Sten 将基因克隆入pⅧ19．T载体中，测序确认。经限制性内切酶跏尺I、黝f 胺凝胶电泳(SDS．PAGE)和免疫蛋白印迹技术(Westemblo位ing)对表达产物进行分析鉴定。 2．Arr姻ten蛋白的纯化 超声破菌，分离得到包涵体，在变性条件下采用金属螯合亲和层析(IMAC)方法纯化 』慨咖n蛋白。使用Ni2+．N1’A亲和柱，通过pH洗脱和咪唑洗杂结合的方法，对洗脱缓冲液和 洗杂缓冲液进行优选，探寻加resten蛋白的最优纯化条件，用BCA法测定纯化产物的蛋白含 量，SDS．PAGE电泳检测纯化产物的纯度，并进一步对纯化产物复性。 3．Ar№sten蛋白的药效学研究 析艋est％蛋白作用下两种细胞凋亡的情况；细胞侵袭试验观察加TeSten蛋白对两种细胞侵袭 能力的影响。 (2)鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验观察A丌eSten蛋白对新生血管的抑制情况。 白，对照组注射0．1ml生理盐水，每2天一次，共lO天。观察瘤体大小变化、小鼠活动能力、 饮食等状况。10天治疗后处死小鼠，摘取肿瘤，称量瘤重，计算肿瘤体积(tumorvol啪e，TV)、 tIlmor l抗体染色免疫组化方 相对肿瘤体积(relativevolume，R1w)及相对肿瘤抑制率。利用CD3 法检测肿瘤组织血管生成情况。 结果： 1．测序结果和酶切鉴定证实A玎esten基因正确地插入表达载体中。经SDS．聚丙烯酰胺凝 000， 表达量约占菌体总蛋白的30％。经Westemblotting检测表明该异源重组蛋白具有添加的亲和 2．通过对洗脱缓冲液和洗杂缓冲液的优化研究，发现采用含有15mM咪唑的洗杂缓冲液 洗涤杂蛋白，能有效减少杂质蛋白的非特异性结合：调整洗脱缓冲液pH值为5．1，可使目的 蛋白更好的洗脱下来。建立了最适宜于A仃esten蛋白的纯化方法，可以一步得到纯度在97％以 上的Arrcsten蛋白。 白浓度，抑制率基本不变。 较为明显。经—缸reSten蛋白作用，血管数目明显减少，血管辐辏低，以非特异性的杂乱、平行、 贯穿等表现形式为主，出现血管细小稀疏、分支少、甚至血管断裂、毛细血管消失等现象。 5．Amsten蛋白注射治疗组小鼠治疗前后饮食、行为无明显异常，反应能力、营养状况 良好，加TeSten蛋白在小鼠体内未引起明显免疫反应。在治疗第5天瘤体增长速度开始减慢， 7天后肿瘤体积开始缩小。而阴性对照组小鼠随着时间延长，肿瘤呈进行性生长，饮食、活动 肿瘤抑制率为80．8l％。经CD3l多克隆抗体检测发现，治疗组瘤组织内血管形成明显减少。 结论： 本研究应用基因工程技术，在加托sten基因序列羧基端引入特异性纯化标签六联组氨酸标 度97％的加代sten蛋白的制备方法。生物学活性研究证明，纯品√妇sten蛋白具有良好的抑制 血管生成及抑制肿瘤浸润转移作用，对小鼠移植瘤有治疗效果。本研究是新型抗肿瘤制剂 加TeSten蛋白新药申报材料的核心组成部分，为ArreSten蛋白的开发奠定了基础。 关键词：Arr鹤ten原核表达蛋白纯化肿瘤血管生成 山西医科大学硕士学位论文 PurificationandFunction oftheanti—tumor Study protein