耐热链替代扩增应(tSDA)用于HBV DNA保守序列扩增的初步研究.pdfVIP

摘 要 目的： 链替代扩增反应(SDA)是～种体外等温核酸扩增方法，基予限制性 内切酶打开缺闪和无外切酶活性的DNA聚合酶在缺口处聚合替代的原 理。本研究将其用于乙型肝炎病毒DNA保守区的扩增，旨在了解SDA方 法在简化程序、扩增效率和敏感性方面是否存在优势，为探讨其用于基因 芯片杂交的可行性奠定基础。 方法： 从DDBJ／EMBL数据库中调取乙型肝炎病毒(HBV)全基因组序列共 X序郧 77条，箕涵盖了A～G7个基因型和两个未定型的序列。用Clustal DNA的保守序列，并结合SDA 分析软件对上述序列遴千亍对比，找到HBV 常用限制性内切酶识别序列，设计并合成SDA引物和其它特异引物。 f从某暇院收集60份HBsAg阳性敷清标本，剥照标准核酸提取程穿获 得HBVDNA，并用以X．PreC保守嚣为靶序列的～对特异性引掳进行PCR lO 反应作为验证实验，产物大小为3 bp。55份PCR检测阳性标本用予SDA 扩增，SDA反成在某一恒定温度下进行，奠反成成分除引物和必要豹缓冲 体系外，避有两种耐热酶即限制性内切浆挑口雪I和BstDNA聚合酶(二者 均来自嗜热脂肪芽孢杆菌)。本研究对SDA反应体系韵钾离子浓度、酶豢、 靶序列拷贝数及引物选择等多方面避行摸索和优化。SDA产物检测分别采 用了2．O％普通琼脂糖凝胶电泳、15％变性和非变性聚爵烯酰胺凝胶电泳、 基圆芯片及微孔板杂交等方法。电泳采用赢接点样、EB染色和在紫夕F姆 下观察结果；蘩因芯片采用SDA反应过程中掺入邋当比例Cy5荧光标记 的dUTP，与固定在芯片上的探针杂交。 前三种SDA产物检测方法检测结果均不理想，于是我们采用了微扎 板杂交。微扎板杂交狳采用生物豢标记dUTP掺入SDA产物的方法外，本 研究还将未标记的SDA扩增产物纯化厝包被子其离吸附力的徽孔板上。 再用生物素标记的搽针与其进彳予杂交，杂交信号用生物綮一亲和索和辣根 过载化物酶～TMB漫色系统来检测。，，、 (，结果： 典型的SDA引物3’j5’端依次为靶序列特异结合区、限制性内切酶识 别位点及5端长约20个核苷酸的保护碱基。根据序列对比结果限制性内 切酶识别位点确定为BsoBl酶切识别序列CITCGAG及相应的磷酸硫酸化 修饰碱基dCTP[aS]，靶序列特异结合区确定为HBV的X—PreC保守区。 另外，参照文献并进行序列对比后，5’端保护碱基确定为 CGATTCCGCTCCAGACTT。 SDA产物采用直接的普通琼脂糖和变性／非变性聚丙烯酰胺电泳检测 见产物呈弥散分布且有拖尾现象；基因芯片杂交信号弱，且结果不稳定。 单引物介导的耐热SDA扩增产物进行的微孔板杂交结果显示：该体 系获得了HBVX—PreC区部分保守序列的线性扩增。本研究还采用了55 SDA 份HBsA阳性血清进行改进的 g,酶，交杂板孔微物产应反，应反增扩 标仪读取杂交信号。其中有43份儿50值大于O．25，均高于空白对照和阴 性对照A450值两倍以上，但远远低于PCR扩增反应的阳性对照(～50值可 达O．7以上)。 除此以外，本研究还对SDA反应的重要影响因素如钾离子浓度、初 始靶分子拷贝数、反应温度、酶的绝对浓度和BsoBI／BstDNA聚合酶比例 进行了摸索和优化。当体系无钾离子存在时，杂交信号较低，A450O2， 应的产量，大于100mmol／L的钾离子浓度对SDA反应不利；随着初始模 板量的增加，SDA产量也呈线性增加。单引物SDA扩增当靶分子数达i04 以上时，微孔板杂交结果显示其A450值在02以上；BstDNA聚合酶量为 8U／501xl时，限制性内切酶为24U／50p-1时杂交效果较好√1 结论： 尽管SDA不需要温度循环，但从本研究结果来看，SDA反应影响因 素较多，较难控制和标准化，造成结果缺乏稳定性。SDA能否作为一种基 因芯片应用中理想的扩增方法还有待于对该技术的进一步改进。 ， 石 关键词：链替代扩增融霹踟棚瑚淤DNA聚合酶体系