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现代分子生物学PBL―基因敲除 导语 随着越来越多全基因组被测序，功能基因组学成为时下研究的热点。研究基因功能的主要有两种思路，一是增强其表达，取得表达产物进行研究，二是减弱或终止其表达，观察整体功能的变化，进而推测相应的基因功能。前者因不能反映基因产物的真实表达情况，而逐渐被抛弃。后者将基因与生物的整体功能联系起来考察，并能为基因的功能提供直接的证据，因而其技术得到不断的完善和发展，其中最常见的就是基因敲除技术。 基因敲除Gene knockout 基因敲除 基因敲除（gene knockout）是指一种遗传工程技术，针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏障，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。 基因敲除技术 同源重组 RNAi 随机插入突变 利用同源重组进行基因敲除 首先基因敲除是在同源重组和胚胎干细胞的获取及体外培养等技术及理论基础上逐步发展和完善的。 其次同源重组法基因敲除主要利用 DNA转化技术, 将含有目的基因和靶基因同源片段的重组载体导入靶细胞, 通过载体与靶细胞染色体上同源序列间的重组, 将外源基因整合入内源基因组内, 使外源基因得以表达。通过研究靶细胞或者个体在目的基因插入前后遗传特性的改变, 达到研究基因功能的目的。 利用RNAi进行基因敲除 RNA干涉（RNAi）是由双链 RNA(dsRNA) 分子在mRNA 水平关闭相应序列基因表达或使其沉默的过程.。是一种典型的转录后基因调控方法。同时也是生物基因组削弱或抵抗外来遗传信息入侵一种保护性机制。 RNAi的作用机制主要可概括为： ①﹑外源性dsRNA被Dicer酶切割成约21-23bp的siRNA片段。 ②﹑siRNA与某些蛋白质结合形成沉默复合物（RISC) ③﹑RISC被激活。 ④﹑RISC 引导siRNA 特异性识别并切割 与之互补的mRNA,导致靶mRNA 的降解 。 利用随机插入突变法进行基因敲除 基因定点敲除虽然是最直接的研究基因功能的方法, 但是对开花植物而言, 缺乏高效实用的定点突变技术。目前较为有效的方法是大规模的随机插入突变, 它为在基因组范围内敲除掉任何一个基因提供了可能。这项技术具有效率高、 基因完全失活、 容易分离鉴定被插入引起失活的目的基因等优点。 T-DNA转移过程中主要可分为分为如下几个步骤 ① 农杆菌对植物细胞的识别和附着 ②农杆菌对植物信号物质的感受 ③ 农杆菌 vir 基因的活化 ④T-DNA复合体的产生 ⑤ T-DNA复合体从细菌细胞输出 ⑥T-DNA 复合体输入植物细胞核 ⑦T-DNA整合到植物基因组中 转座子的分类 简单转座子 存在于染色体DNA上可自主复制和移位的基本单位，是染色体或质粒DNA的正常组成部分。 复合式转座子 是一类带有某些同转座无关的一些基因。 转座子介导的基因敲除 通过将目的基因插入转座子形成复合式转座子，在通过转座子的可移动性将目的基因转入染色体上。从而形成重组植物，通过研究重组前后植物的各种变化来推测目的基因的功能。 基因敲除的应用前景 建立人类疾病的转基因动物模型，从动物体内进行疾病的研究。 提供廉价的异种移植器官 （将产生异源分子的基因敲除，使人体异源分子的免疫排斥反应降低） ·改造生物、培育新的生物品种 谢谢 * T-DNA插入突变 植物病原细菌 ―根癌农杆菌的 T i 质粒上有一段 T-DNA, 又称转移DNA , 约占Ti质粒DNA总长度的 10 % 左右 , 当病原菌致病过程中 , 它能随即且稳定地整合到植物基因组中 , 并能稳定地表达 。 目前农杆菌介导的T-DNA 插入突变主要用于构建所要研究植物的插入突变体库 。 转座子是首先在玉米中发现的生物体基因组上的可移动和自主复制的遗传元件。转座子的存在和在基因组中的转移可以直接或间接地造成基因重排 在基因组中引入变异。 转座子插入突变 目前存在的主要问题 一, 基因定向敲除的成功率很低, 检测发生同源重组干细胞的工作比较困难。 二, 尽管小鼠的繁殖周期为 19~ 21 d, 但从定向敲除干细胞基因到筛选出具备理想基因型的基因敲除小鼠模型依旧耗时极长。 三, 基因敲除后的功能可能被其它基因的代偿作用填补, 因此并不表现表型缺陷。 *