慢性温与应激加速动脉粥样硬化病变形成及其Toll样受体4途径的作用的分析.pdf

NF-κB 等信号转导通路，诱导炎性细胞因子的转录（如TNF-α ），进一步激活细 胞的免疫功能。实验提示：TLR4 是连接免疫、脂质代谢与AS 的桥梁；在慢性 应激所致的免疫应答中也可能有着重要作用。因此， 本研究通过建立 CMS apoE-/- AS 小鼠模型来探讨CMS 对AS 的发生与发展的影响，及其TLR4 途径在 该模型小鼠AS 发生、发展当中的作用和机制。 目的 1. 慢性温和应激能否加速apoE-/-小鼠AS 的发生与发展。 2. 慢性温和应激对apoE-/-小鼠主动脉TLRs 信号通路基因表达的影响。 3. 构建Ad-TLR4 siRNA 干扰载体并转染apoE-/-小鼠，研究TLR4 siRNA 干扰对 CMS apoE-/- 小鼠主动脉 AS 发生、发展的影响及其对主动脉 TLR4/NF-κB-MCP-1、ICAM-1、IL-1β 和TNF-α 基因表达的影响。 方法 1. 慢性温和应激apoE-/-AS 小鼠模型的建立及其TLRs 信号通路基因表达研究 1.1 实验动物应激方案 4 周龄apoE-/-小鼠120 只平衡一周后随机分为2 组：对照组（control 组）和 慢性温和应激组（chronic mild stress ，CMS 组）；每组60 只。实验动物都以高脂、 高胆固醇饲料（5 ％猪油，1％的胆固醇）的喂养。本实验所采用的应激方案在Ipek Yalcin 等建立的慢性应激模型基础上进行了改进，具体应激方案如下：垫料用水 打湿 17h （每周1 次）；昼夜颠倒7 或 17h （每周2 次）；鼠笼倾斜成45 度角7 或17h （每周2 次）；噪声刺激9 或15h （每周2 次，80dB）；恐惧刺激1h （放入 大鼠刚住过鼠笼、每周2 次）。应激试验组小鼠按顺序接受每个应激源的刺激。 应激组的小鼠分别在接受应激刺激0 周（n ＝20 ），4 周 （n ＝20 ），12 周（n ＝20 ） 3 个时间点处死动物。对照组的小鼠关在单独的实验动物房，除了不给予应激刺 激外，其它的实验条件与应激组相同。分别在试验开始后的第0，4 ，12 周3 个 时间点处死动物。 1.2 糖皮质激素浓度与蔗糖偏嗜度测定 所用apoE-/-小鼠首先接受训练饮用1％的蔗糖水：在开始的48h 内将蔗糖水 2 放入鼠笼中以代替灭菌的蒸馏水，接着禁食禁水 8h，通过称饮水瓶前后重量， 连续测量3 次动物在1h 内的饮水量，计算方式如下： 饮用1％蔗糖水重量＝饮用前饮水瓶的重量-饮用1h 后饮水瓶的重量 125 此后每周进行一次8h 禁食禁水和1h 饮蔗糖水测试。采用 I-皮质酮放射性免疫 检测试剂盒测定血浆皮质酮的含量，此过程贯穿于整个实验。 1.3 CMS 对apoE-/-小鼠主动脉AS 病变面积测定 从腹主动脉分叉至主动脉弓将主动脉剪下，干净剔除主动脉血管外的脂肪组 织后，将主动脉树纵向剪开，主动脉树以用苏丹Ⅳ染色观察整个主动脉的病变。 主动脉窦连续10μm 冰冻切片进行油红O 染色，观察主动脉AS 病变。 1.4 CMS 对apoE-/-小鼠TLR4/NF-κB-MCP-1、ICAM-1、IL-1β 和TNF-α 基因表达 水平的测定 Real-time PCR 芯片分析 apoE-/- 小鼠主动脉 TLRs 信号途径基因表达； Western blotting 方法检测apoE-/-小鼠主动脉TLR4 和NF-κB 的表达水平，免疫 组化染色观察主动脉窦AS 病变处TLR4 的表达；ELISA 法检测apoE-/-小鼠血清 中的MCP-1、ICAM-1、IL-1β 和TNF-α 表达水平。 2. Ad-TLR4 siRNA 干扰对CMS apoE-/-小鼠主动脉AS 发生、发展及其对主动脉 TLR4/NF-κB-MCP-1、ICAM-1、IL-1β 和TNF-α 基因表达的研究 2.1 Ad-TLR4 siRNA 干扰载体构建 2.1.1 有效封闭TLR4 表达的小分子干扰RNA 载体构建 设计、合成两对特异性针对TLR4 基因的小分子干扰RNA 序列，分别构建 小分子干扰 RNA 载体 pRNAT-TLR4-