现代生物技术应用资料.ppt

* * * * * * * 现代生物技术的应用 现代生物技术广泛用于改造抗生素和生物制品等传统医药工业。主要体现在以下几个方面: ①抗生素：可从产生菌中分离出生物合成酶基因，进行克隆，提高生产菌 的生物量，或得到新的杂合抗生素。 ②氨基酸：利用生物技术得到基因克隆的生产菌，或采用融合技术提高氨 基酸产量。 ③维生素：构建基因工程菌，简化维生素的生产工艺（如Vit C）。 ④疫苗： 利用基因工程技术将抗原克隆到E.coli或酵母中，用工程菌生产 疫苗，产量高、工艺简单、操作安全。 基因工程在抗生素生产中的应用 　　抗生素生物合成并非单一基因的直接产物，而是由初级代谢产物经过一系列酶催化产生的次级代谢产物，其形成过程是一个复杂的、多因素调节的过程。 　　传统的提高微生物产生抗生素能力的方法主要是用诱变剂（如紫外线、化学诱变剂等）处理微生物，获得生产能力较高的突变株。80年代，人们开始将DNA重组技术应用于次级代谢产物的生物合成上；通过生物合成酶基因的分离、质粒的选择、基因重组与转移、宿主表达等方面。 一、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法 1.抗生素（链霉素）生物合成基因的结构特点 ① 链霉菌抗生素生物合成基因组的一个典型特性是G-C碱基组成， （G+C）%高达70%以上；且三联体密码子中第3个碱基G、C比例极高 ②抗生素生物合成基因大多处于一个基因族中 ③抗生素生物合成基因除定位在染色体上外，有的定位于质粒上 2.克隆抗生素生物合成基因的策略和方法 ①在标准宿主系统中克隆检测单基因产物 ②阻断变株法 ③突变克隆法 ④直接克隆法 ⑤克隆抗生素抗性基因法 ⑥寡核苷酸探针法 ⑦同源基因杂交法 ①在标准宿主系统中克隆检测单基因产物 鸟枪克隆法：这是一种由生物基因组提取目的基因的方法。首先利用物理方 法(如剪切力、超声波等)或酶化学方法(如限制性内切核酸酶)将生物细胞染色体DNA切割成为基因水平的许多片段，继而将这些片段与适当的载体结合，将重组DNA转入受体菌扩增，获得无性繁殖的基因文库，再结合筛选方法，从众多的转化子菌株中选出含有某一基因的菌株，从中将重组的DNA分离、回收。这种方法也就是应用基因工程技术分离目的基因，其特点是绕过直接分离基因的难关，在基因组DNA文库中筛选出目的基因。可以说这是利用“溜散弹射击”原理去“命中”某个基因。由于目的基因在整个基因组中太少太小，在相当程度上还得靠“碰运气”，所以人们称这个方法为“鸟枪法”或“散弹枪”实验法。 利用鸟枪克隆法，把抗生素产生菌DNA克隆到最常用的宿主——变青链霉菌中，通过检测宿主菌中个别基因产物，筛选克隆，从而分离到相应的基因。 ②阻断变株法 通过一系列阻断变株的互补结果来确定被克隆DNA片段的性质。即首先经诱变获得一系列生物合成阻断变株（不能合成抗生素），用互补共合成法来确定这些变株在生物合成途径中的相互位置。从野生型菌株中分离DNA，与载体连接后转入阻断变株，以抗生素表型的恢复作指标，克隆生物合成不同阶段的酶基因。 ③突变克隆法 利用整合质粒或噬菌体，将原株DNA转入到抗生素产生菌中。由于基因有同源性，有可能发生基因重组，一旦某DNA片段的插入干扰了原株某个生物合成基因的转录，即得到这个生物合成基因的阻断变株，其相应的DNA片段就是这个阶段的生物合成基因。 此法由于要利用噬菌体，因而有一定局限性。 ④直接克隆法 　　将抗生素产生菌的ＤＮＡ部分酶切的２０～４０bp的片段连接到质粒的表达位点上，转化变青链霉菌，培养，筛选具有抗菌活性转化子。 　　由于抗生素生物合成基因往往成族存在，使得有时可能需要克隆整套生物合成基因。故此法主要用于基因族相对较小（≤30kb）的抗生素生物合成基因。 ⑤克隆抗生素抗性基因法 　　　抗生素生物合成基因和抗性基因往往是连锁的，表达也是协同的（否则菌体本身没有抗性，容易被自身所产生的抗生素杀灭），且抗性基因一般只有１～２kb，容易检测于克隆。 　　先将抗性基因克隆到标准宿主或产生菌的敏感突变株中，再分析与之紧密连锁的ＤＮＡ，就可能找到生物合成基因；也可利用已经克隆的抗性基因作为探针，从产生菌基因文库中分离与之同源的并带有生物合成基因的ＤＮＡ片段。 ⑥寡核苷酸探针法 　　根据抗生素生物合成酶基因的氨基酸序列，推导出其基因序列，然后人工合成寡核苷酸，并以此寡核苷酸作为探针，从基因文库中克隆出相应的生物合成基因。 ⑦同源基因杂交法 　　利用一种已经克隆的抗生素生物合成基因片段为探针，探测相关抗生素同源基因，最后分离及克隆抗生素生物合成基因。 二、提高抗生素产量 在抗生素生产过程中，获得高产菌株的传统方法是通过诱变