血运重建联合曲美他嗪预处理骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死的实验的分析.pdf

血运重建联合曲美他嗪预处理骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死的实验研究 中文摘要 血运重建联合曲美他嗪预处理骨髓间充质干细胞移植治 疗急性心肌梗死的实验研究 中文摘要 目的：利用曲美他嗪（TMZ ）预处理骨髓间充质干细胞（BMSCs ），于心肌梗死 急性期行血运重建联合细胞移植治疗，研究其对心功能改善的影响，并初步探寻其作 用的机制。 方法：体外部分：取6-8周龄SD大鼠的胫骨及股骨分离骨髓间充质干细胞，用全 骨髓差异贴壁法培养及纯化BMSCs ，并取第3代BMSCs用于本实验。利用1-3天的SD 乳鼠心脏在体外分离培养新生大鼠心室肌细胞（NRVMs ），取原代培养第3天的心肌 细胞，分别收集正常和缺氧/复氧（H/R ）处理的心肌细胞上清液，对其上清液中乳酸 脱氢酶（LDH ）、丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD) 的含量进行检测。将P3代 BMSCs分为以下四组：①Control组：BMSCs+正常细胞培养液；②H/R组：BMSCs+H/R 上清液；③TMZ组：TMZ预处理BMSCs +正常细胞培养液；④TMZ+ H/R组：TMZ预 处理BMSCs+H/R上清液。利用CCK-8法检测上述各组BMSCs 的细胞活性，RT-PCR检 测其细胞Bcl-2 、Bax 的表达。 体内部分：细胞移植前用荧光染料CM-Dil标记BMSCs ，建立大鼠心肌缺血再灌 注(I/R)模型32只，随机分为四组：①Sham组：冠脉只穿线不结扎；②I/R组：结扎冠 状动脉1h后开放阻断的冠脉（模拟血运重建），注射无细胞的上清液；③BMSCs组： 结扎冠状动脉1h后开放阻断的冠脉，注射无药物预处理干细胞；④BMSCs+TMZ组： 结扎冠状动脉1h后开放阻断的冠脉，注射药物预处理干细胞。各组于I/R后3h采集大 鼠血清进行LDH 、MDA及SOD的测定。术后1周各组随机处死2 只大鼠，检测其植入 体内的BMSCs 的存活数量，其余大鼠饲养至移植后4周接受心功能测定，检查后处死， 其中每组3只用于计算梗死面积，其余3只取心脏组织用于蛋白提取，Western Blot分 析Bcl-2及Bax 的表达。 结果：体外部分：1.与正常对照组比较，经过 H/R 处理过的心肌细胞上清液中 I 中文摘要 血运重建联合曲美他嗪预处理骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死的实验研究 LDH 、MDA 活性显著升高（P0.05 ），SOD 活性降低（P0.05 ）。2.在BMSCs 与心肌 细胞上清液共培养各组中，H/R 组细胞活力较Control 组显著下降 （P0.05 ），但培 养前经过TMZ 预处理后，该组细胞的活力较H/R 组可显著提高（P0.05 ）。3.RT-PCR 结果表明：H/R 组细胞 Bcl-2 的基因表达水平稍有减少，但与正常组相比无差异 （P ＞0.05 ），但TMZ+H/R 组细胞Bcl-2 的基因表达水平较H/R 组相比，前者明显高于 后者，差异有统计学意义（P ＜0.05 ）；H/R 组细胞Bax 的基因表达水平稍有增多， 可与正常组相比无差异（P ＞0.05 ），但TMZ+H/R 组细胞Bax 的基因表达水平较H/R 组相比，前者明显低于后者，差异有统计学意义（P ＜0.05 ）。 体内部分：1.用“二线二结”法能够方便、成功地建立大鼠在体心肌缺血再灌注 模型。2.与Sham 组比较，再灌注后3h 其余各组LDH 、MDA 活性均显著升高（P0.05 ）， SOD 活性均显著降低（P0.05 ），三组组间两两比较无明显差异（P0.05 ）。3.术后 1 周，将组织进行快速冰冻切片，在荧光显微镜下计数双标记 BMSCs ，发现 BMSCs+TMZ 组每个高倍镜下双标记细胞数显著高于BMSCs 组 （P ＜0.05 ）。4.术后 4 周，BMSCs 组和 BMSCs+TMZ 组均较 I/R 组心功能得到改善 （P0.05 ），但 BMSCs+TMZ 组相比BMSCs 组心功能改善的更加明显 （P0.05 ）。5.与I/R 组相比， BMSCs 组和 BMSCs+TMZ 组均能减少梗死面积 （