大肠杆菌与铜绿假单胞菌中蛋白表达监测系统构建.pdf

大肠杆菌和铜绿假单胞茵中蛋白表达监测系统的构建 中文手两要 20世纪90年代，‘‘‘人类基因组计划”的推进和完成，标志着“后基因组时代”的到 来，“功能基因组学中蛋白质组学的研究提上了未来生命科学研究的日程。目前蛋白 质研究的主要方法是通过2-DE配合质谱对蛋白质的分离鉴定。虽然对蛋白质的研究技 术在不断地改进，但是目前的生物化学技术已不能满足研究蛋白质组所需要的高灵敏 度、高通量以及可规模化的要求，对于蛋白质组学的研究期待着新型的技术方法的突破。 本课题以大肠杆菌和铜绿假单胞菌为研究对象，采用了将带有RBS的目的基因克隆 测系统；报道基因的表达量取决于克隆基因的转录及翻译水平，利用发光值读取仪检测 CPS值衡量目的基因蛋白质的表达量。对该监测系统进行验证，并将两种菌的全基因组 克隆至各自相应的监测系统中，建立反映蛋白质表达情况的荧光值数据库。 HTc，初步构建得到大肠杆菌的蛋白表 表达载体pPROEXHTa、pPROEXHTb、pPROEX HTc．1ux。报道基因 达监测系统，命名为pPROEXHTa-lux、pPROEXHTb．1ux、pPROEX HTc—lux中翻译时能够正确阅读；并在IPTG梯度浓度条件下， luxABCDE在载体pPROEX HTc．1ux的细菌发光量，由结果可知克隆到蛋白表达载体中的缺 测定含有载体pPROEX 道基因的蛋白表达受到trc启动子调节因素的调节。测定预期的蛋白表达载体pPROEX HTc与报道基因 HTc—lux中的报道基因IuxABCDE两侧的序列，结果表明载体pPROEX luxABCDE连接处的碱基序列与已知碱基序列相同。 在铜绿假单胞菌中，将从已构建的大肠杆菌蛋白表达监测载体酶切后得到的 在大肠杆菌和铜绿假单胞菌中构建的蛋白表达监测方法可以实现高通量、高灵敏 度、规模化以及更直观地对蛋白表达的监测；该监测方法不仅可用于蛋白质组学的基础 理论性研究，而且可用于攻克重大疾病和开发生物医药等领域的实践应用性研究。 关键词：大肠杆菌，铜绿假单胞菌，蛋白表达监测系统 ConstructionofProtein in Expression MonitoringSystem EscherichiacoliK12andPseudomonas Abstract Genomicshasbeenfocusedon researchersthe20m by during century．Thenproteomics Was themain directioninthe eraafter being studying post—genomicthe of accomplishment the‘HumanGenome methodslike2-DE withMass Project”．Various technique Spectrometry were usedfor and usually still isolatingidentifyingproteins．However，t