池蝶蚌外套膜组织学及钙调蛋白基因克隆与表达特性分析.pdf

摘要 摘要 池蝶蚌(Hyriopsisschlegeli)作为一种引进的优质的淡水育珠蚌，已经广泛应 用于我国的淡水育珠产业中。贝类培育珍珠的重要部位是外套膜，然而到目前 为止，有关池蝶蚌外套膜的组织学结构的研究还未见有报道，并且对参与和调 控淡水珍珠形成的基因研究也属空白。本研究用传统的石蜡切片和H．E染色技 术对池蝶蚌外套膜不同部位的组织结构进行了详细的观察，并对不同部位边缘 突起的厚度、形状、面积进行了研究，同时成功克隆了池蝶蚌钙调蛋白cDNA 的全长序列，并对其表达特性进行了分析。 1、池蝶蚌外套膜的组织结构观察 运用组织学方法对池蝶蚌外套膜不同部位进行了观察。结果表明，池蝶蚌 外套膜由边缘膜和中央膜组成，边缘膜包括三个突起，分别是生壳突起，感觉 突起和缘膜突起。外套膜不同部位的组织结构基本相同，由外表皮、内表皮、 结缔组织和肌肉纤维组成。研究发现不同部位边缘突起的形状、面积等有较大 差异，厚度也不同，一般是蚌体中部和中后部较厚。内表皮细胞问分布有三种 类型的分泌细胞，分别是嗜碱性粘液细胞、大分泌颗粒细胞和小分泌颗粒细胞。 而外表皮上只分布一种空泡状分泌细胞。 2、池蝶蚌钙调蛋白基因的克隆与表达特性分析 结合蛋白，通过与Ca2+结合，并与靶酶相互作用，参与细胞的多种生理活动。 在贝类中，钙调蛋白作为钙离子通道的成员，以及Ca2+-ATPase系统中至关重要 的调节者，在钙离子的获取和转运以形成贝壳的调节过程中起着重要作用。根 据在NCBI数据库中寻找相近物种的钙调蛋白基因序列，设计引物，利用RT-PCR 技术获得钙调蛋白基因的部分序列。同时根据已获得的序列，设计引物，利用 SMART RACE技术分别获得3’端序列和5’端序列，拼接后获得池蝶蚌CaM基 因的cDNA全长为855 bp，开放阅读框(0RF)447bp，编码149个氨基酸，预测 分子量为16．8kDa，等电点为4．14。5’非编码区含70 bp，3’非编码区含309bp， 以及一个由26个A组成的poly(A)尾。与其它物种钙调蛋白基因一样，池蝶蚌 合区域。经过序列比对发现其氨基酸序列与其它物种具有很高的同源性。 II 摘要 运用荧光定量PCR技术分析检测cam基因在池蝶蚌不同组织中的表达情 况，结果表明在池蝶蚌的外套膜、鳃、性腺、斧足、闭壳肌5种组织中均检测 到cam基因的表达，但不同组织中其表达量是有显著差异的。以闭壳肌中cam 基因的表达量为参照，鳃中cam的表达量最高，是闭壳肌中的106倍；其次是 斧足和外套膜，表达量也相当高，是闭壳肌中的60．80倍：性腺中的也高于闭壳 肌中的表达。这5种组织中闭壳肌中cam基因的表达量最低。 同时，还运用荧光定量PCR技术分析检测cam基因在不同年龄池蝶蚌外套 膜组织中的表达情况，结果表明在池蝶蚌不同年龄的外套膜中，cam基因的表达 是有变化的。以2龄池蝶蚌外套膜中cam基因的表达量为参照，4龄的表达量 最高，其次是5龄的，l龄、2龄、3龄池蝶蚌外套膜中cam基因的表达没有 显著差异。 关键词：池蝶蚌；外套膜；组织结构；钙调蛋白；CaM：基因克隆；荧光定量 PCR Abstract Abstract freshwater has Fora introduced schlegelii highquality pearlshell，Hyriopsis inour freshwater mantleof been industry．The wildelyapplied country’s pearls