PCR及反应条件的优化.pptVIP

PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 阴性对照 标本对照:被检的标本是血清就用 鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照 试剂 对照:在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染 阳性对照 4）设立适当的对照 合理分隔实验室 隔离的专用操作区、专用加样器 ①标本处理区; ②PCR反应液制备区; ③PCR循环扩增区; ④PCR产物鉴定区. PCR常见问题之三 非特异性扩增 现象： 1）PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致； 2）或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。 1) 引物特异性差, 引物与靶序列不完全互补、或形成引物二聚体。 其对策: 必要时，重新设计引物。 2) 模板或引物浓度过高 3) 酶量过多或质量不好 4) Mg2+浓度偏高 5) 退火温度偏低 6) 循环次数过多 原因 非特异性扩增 PCR常见问题之四 拖尾 现象：产物在凝胶上呈Smear状态 M 1 2 1) 模板不纯或降解 2) Buffer不合适 3) 退火温度偏低 4) 酶量过多或质量差 5) dNTP、Mg2+浓度偏高 6) 循环次数过多 原因 拖尾 如果是在低分子量部分有smear, 可能是引物dimer,应当减少引物量，或更换引物。  如果是在高分子量部分有smear, 可能是高分子的DNA模板，应减少模板量，或减少循环数。 注意： PCR产物一定要从胶上回收后再用。 PCR的应用 研究 基因克隆，DNA测序，分析突变 诊断 细菌、病毒、寄生虫检测，诊断 肿瘤 各种肿瘤检测 人类基因组工程 遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱 法医 犯罪现场标本分析 其他…… 总之， 希望大家尽可能快地突破技术屏障，掌握技术上的一些看似微不足道、但却是成功秘诀的技巧。 祝大家学会沟通使学习更顺畅！ 实验结束后整理实验台, 值日生值日! 思考题：dNTP的浓度对PCR有什么影响？ 重点： PCR的概念、PCR的原理（How PCR works) 引物设计时应遵循的原则（实例＊＊) 【总结】 变性温度和时间 退火温度与时间 延伸时间、循环次数 Template dNTPs pfu polymerase PCR反应条件的优化 难点：分子生物学软件在引物设计中的应用(new) PCR实验中的常见问题及对策 1．假阴性，不出现扩增条带 2．假阳性 3．出现非特异性扩增带 4．出现片状拖带或涂抹带 Primer should be designed based on exon sequence for PCR. 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） PCR的基本原理 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA变性 形成2条单链 子链延伸 DNA加倍 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 子链延伸 DNA加倍 DNA变性 形成2条单链 模板DNA 95℃ 95℃ 50℃ 引物1 引物2 DNA引物 50℃ 引物1 引物2 DNA引物 72℃ Taq酶 Taq酶 72℃ 第1轮结束 95℃ 第2轮开始 五． PCR反应注意事项 Optimization of PCR condition ＊ (P137) PCR方法操作简便， 但影响因素颇多。 PCR反应注意事项 去离子水（补足反应体系） 39 ?l DNA 2 ?l 10?PCR buffer（含MgCl2）