PCR学生实验.ppt

* * PCR 聚合酶链反应 (Polymerase Chain Reaction ,PCR) Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。 　　1983年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了聚合酶链反应（85年正式公布）。其原理类似于DNA的体内复制 , Klenow酶催化，PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。 (93 Nobel Prize ） 1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。 1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶，Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。 PCR技术的基本原理 　 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。类似于DNA的体内复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 ①模板DNA变性单链。 ②模板DNA与引物的退火(复性) ③引物的延伸 PCR的反应动力学　 DNA扩增量呈指数上升。 反应最终的DNA 扩增量Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示每次扩增效率的平均值，n代表循环次数。 平均扩增效率的理论值为100%， 反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，后进入线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应” ，这种效应称平台期(Plateau)。 PCR扩增产物 　 分为长产物片段和短产物片段 短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5‘端之间，是需要扩增的特定片段。 短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的 “短产物片段”是按指数倍数增加， 而“长产物片段”则以算术倍数增加。 标准的PCR反应体系： 　　　10×扩增缓冲液 　 　　　4种dNTP混合物 　 　　　引物 　　　　 　 　　　　模板DNA 　　　 　　　 　 Taq DNA聚合酶 　 　　　　Mg2+　　　　　　 　　　水 引物： 引物是PCR特异性反应的关键 PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。 设计引物应遵循原则： ???? 引物长度： 15-30bp，常用为20－27mer左右。 　引物扩增跨度： 以200－3000bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。　　 引物碱基： G+C含量以40-60%为宜 ATGC随机分布 避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。? 设计5‘端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。 3’端不要出现3个连续的G或C 3’端不要出现T尤其不要出现2个或以上的T 3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对 3’端最好不要中止于密码子的第3位 　 避免引物内部出现二级结构 　　5’端可加上合适的酶切位点、各种标记物、启动子序列及待突变碱基。当计算引物Tm值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。 　　 简并引物 是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。 为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少简并性。 次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度。 不要在引物的3端使用简并碱基。 使用较高的引物浓度（1μM到3μM），许多简并混合物中的引物不是特异性针对目的模板。 引物的特异性： 引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。 引物量： 引物的浓度0.2～1uM 以最低引物量产生所需要的结果为好 引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 过低将降低反应产物。 酶单位： 在以下分析条件下，于74℃，30min内使10nmmol的dNTP掺入酸不溶性成分所需的酶。 　　 酶及其浓度　 Taq DNA聚合酶及其它一些热稳定聚合酶。 催化一典型的PCR反应约需酶量5U(指总反应体积为100ul时) 浓度过高可引起非特异性扩增，甚至PCR产物为弥散，浓度过低则合成产物量减少。 热稳定性（半衰期） 97℃ ：20