苏云金芽孢杆菌生物农药的制备伴胞晶体的分离纯化及杀虫活性.docVIP

JIUJIANG UNIVERSITY 实 验 论 文 题 目 苏云金芽孢杆菌生物农药(Bt制剂)的制备、伴孢晶体的分离纯化及杀虫活性 院 系 生命科学学院 专 业 生物技术 姓 名 樊晓乐、严学芬、王伟、 周明宣、邹红虹 班 级 B0933 指导教师 张炳火 二零一一年 十一 月 摘要：苏云金芽孢杆菌是目前世界上研究最多、产量最大、应用范围最广的微生物杀虫剂，具有专一性强、对人畜无害、防治效果好、易生物降解及无残毒等优点。本试验采用固体培养，对一株苏云金芽孢杆菌进行了发酵，制备了Bt制剂，对伴孢晶体进行了分离纯化，采用菜地试验，检测了Bt制剂和伴孢晶体对白菜虫害的防治效果。 关键词：苏云金芽孢杆菌（Bt）；伴孢晶体；杀虫活性 前 言 苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）是一种革兰氏阳性细菌，其菌体为短杆状，生鞭毛，单生或形成短链。它在芽孢形成过程中产生称为δ-内毒素的杀虫伴胞晶体蛋白(控制合成这种蛋白质的基因在质粒上），这些蛋白具有很高的杀虫活性。Bt由于具有专一性强、对人畜无害、防治效果好、生物降解无残毒、所用原料简单等优点，在虫害防治中发挥着越来越重要的作用，随着对Bt研究的深入，Bt的基因改造、毒理学研究、杀虫机理、对人类的安全性等方面的研究都对高纯度的Bt伴胞晶体提出了极大的需求。 因此，Bt伴胞晶体的分离纯化方法逐步得到了发展，如等密度梯度离心法、液体双相分离法、等电点沉淀法、离子交换分离法、碱裂解法、高速离心法和生物物理法等。 本实验采用2种液体培养基、2种培养条件对苏云金芽孢杆菌进行培养。镜检观察当90％ 以上的芽孢脱落时处理菌体，经碱液裂解后比较等电点沉淀和液体双相分层法提取Bt蛋白的收率和纯度。 1 材料与方法 1.1 菌种 苏云金芽孢杆菌为九江学院生命科学学院微生物实验室保藏。 1.2 培养基 种子培养基：牛肉膏 0.5%,蛋白胨 1.0%,NaCl 1.0%,调pH 7.2 左右,121℃灭菌30 min。 发酵培养基：牛肉膏0.5%,蛋白1.0%,葡萄糖0.3%,NaCl 0.2%, MgSO4·7H2O 0.03%, K2HPO4 0.03%, MnSO4 0.005%,调pH 7.5,121℃灭菌30min,灭菌后pH 7.3。 1.3 实验仪器与药品 实验仪器：培养皿，离心机，试管，接种针，移液枪，高压蒸汽灭菌锅。 实验药品：牛肉膏，蛋白胨，NaCl，葡萄糖，MgSO4·7H2O，K2HPO4 ， MnSO4。 1.4培养方法 1.4.1 种子液的培养 将苏云金芽孢杆菌孢子接入种子培养基中培养 1.4.2 菌株发酵 将种子培养基中的苏云金芽孢杆菌接入发酵培养基中进行发酵 1.4.3 Bt制剂的制作 将苏云金芽孢杆菌离心获得蛋白质粗制品 1.5 苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的分离纯化 将裂解得到的溶液冷冻离心（4 ℃ 、4000r/min）30min后，除去上清液，将芽孢与伴孢晶体充分分离。用无菌水洗涤沉淀，除去剩余的芽孢与杂质。用0.5mol/L NaCL洗涤沉淀，消除晶体中内生蛋白酶对晶体的被特意降解。得到的悬液继续沉淀30min，去除上清液，像沉淀中加1mol/LNaCL+0.01%TritionX-100制成孢晶悬液在0~4℃静置24h。 将静置后的悬浮液离心，然后溶于0.001mol/LNaCl+0.01% TritionX-100+2%甘油中，静置10min离心，沉淀制成水悬液。将利用高速离心法得到的水悬液装入透析袋中透析4h，已除去高速离心中引入的盐杂质，再放入冰箱中冷冻过夜，即得到淡黄色的伴孢晶体粉末。 1.6伴孢晶体蛋白对菜青虫的防治试验 1.在菜地取三个边长为20 cm的正方形，分别做标记为Bt制剂、伴孢晶体和对照。 2.按照标记分别撒上Bt制剂、伴孢晶体和无菌水。 3.十五天后观察并记录分别撒上Bt制剂、伴孢晶体和无菌水的白菜的长势，统计眼虫数量。 2结果与分析 2.1 Bt制剂 将培养液转移到离心管中4000r/min离心30min，收集沉淀，用0．5 mol／L NaC1和生理盐水各洗涤1次，离心(4000／min) 30min，收集沉淀，取一半沉淀，与适量土混合，放在恒温干燥箱中，即得。 2.2 伴孢晶体的提取及晶形检测 取另一半沉淀，称沉淀重量，以0.070 g／