草果试验相关方法.docVIP

A.草果花部综合征与开花物候 花粉在柱头萌发的荧光镜观察 一．目的及意义 在盛花期，选取开花后不同天数花朵，FAA固定。通过荧光镜观察，初步掌握荧光显微镜的使用方法及了解花粉在柱头上萌发的状况。 二．原理和方法 在草果柱头萌发的花粉，可用苯胺蓝试剂染色，造成与柱头或花柱组织染色上的分化而明显区别。荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光3650入或紫蓝光4200入)作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观察。这样在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高，可对草果花粉的荧光现象进行观察和拍照。 三．材料及药品 材料：盛花期内，开花不同时期的花朵 药品：FAA,6mol/L NaOH,蒸馏水，0.05%苯胺蓝（pH9-10磷酸缓冲液） 四．实验步棸 采集在盛花期，选取开花后不同天数花朵，置于离心管内FAA固定，带回实验室（FAA的配制：福尔马林（38％甲醛）5ml＋冰乙酸5ml＋70％酒精90 ml苯胺1 g ，溶于 35％或95％酒精100ml 严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序。进人暗室后接通高压稳压器电源，后再开启激发高压汞灯，当看到高压汞灯完全亮后，停止激发，再开始观察标本。 荧光显微镜的激发装置及高压汞灯寿命有限，标本应集中检查，节省时间；汞灯应避免多次开启，半小时内。 20个，花20朵，游标卡尺。 方法： 于花蕾期标记花期相近的健壮植株的花序20个，花20朵，每天观察一次花蕾，直至花朵开放。花开放当天，每隔2 h观察一次。观察单花进程，测量柱头上举的角度及时间（此处操作极为困难，可不做）。从早6-7点开始，到下午花谢为止。尤其注意早6-7点及下午3-4点区段，此量区段应连续观察。花朵开放之后，每天观察一次，记录花朵形状、颜色、柱头状态变化情况等。每个类型选取10株，每株摘取3朵开放的花进行观察、测量、记录花瓣和萼片的长度、颜色、大小，雄蕊和雌蕊各部分长度、颜色、形状等。摘取不同时期的花照相，对不同时期的花序进行照相. B.草果繁育系统 杂交指数的估算 材料： 草果植株10株，游标卡尺 方法： 按照Dafni(1992)的标准，在观测点选取个体10株，每株2朵花，进行花朵的直径及开花行为的测量评判。具体方法是：① 花朵直径1mm记为0，1～2mm记为1，2~6mm记为2，6 mm记为3。② 花药开裂时间与柱头可授粉期之间的时间间隔同时或雌蕊先熟记为0，雄蕊先熟记为1。③ 柱头与花药的空间位置同一高度记为0，空间分离记为1。 三者之和为OCI值。评判标准为：OCI=0时，繁育系统为闭花受精型；OCI=1时，繁育系统为专性自交型；OCI=2时，繁育系统为兼性自交型，有一定一交可能；OCI=3时，繁育系统为兼性异交型，部分种需要传粉者；OCI=4时，繁育系统为异交型，部分自交亲和，多数种需要传粉者。 花粉—胚珠比的估算 材料及试剂： 草果花朵每类各20朵，FAA固定液（配制方法同上）,离心管，1.0 mol/L HCl，水浴锅，移液枪，显微镜，解剖针。 方法： 在观测地点，随机采取花药尚未开裂的花朵，每种类型20朵，用FAA固定液固定（以下内容回学校后实验室内进行）。 从固定液中选取大小基本一致、开花进程相近的花朵10个，从花中取下花药，用1.0 mol/L HCl软化花粉壁。然后细心的解剖花药，将花粉全部移人1个有刻度的离心管，用蒸馏水定容至5 ml。在水浴锅中于60℃下水解15 min，震荡摇匀后用移液枪吸取1 μl 的花粉液于载玻片上，在显微镜下观察并统计花粉数，每朵花重复5次。将子房置于载玻片上，将胚珠从胎座中解开，观察并计数。每朵花的花粉/胚珠比率用其花药中的花粉数除以其子房中的胚珠数得出。依据Cruden[9]的标准进行授粉方式的判断。 C.草果花粉活力和柱头可授性 花粉活力测定 材料及试剂： 每类花序各20个（在未开花时事先套袋），载玻片，I2—KI试液（配方：碘化钾g ； 蒸馏水00ml ； 碘1g 先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，待全溶解后再加碘，振荡溶解后稀释至00mL，保存在棕色玻璃瓶内。2h取样观察。每个花序取3朵花，花粉混匀，取少量的混匀花粉于洁净的载玻片上，加水一滴，使花粉散开，再加一滴I2—KI溶液，盖上盖玻片，置于室温下2h 后，置于光学显微镜下观察5个视野，。凡花粉粒被染成蓝色的表示具有生活力，呈黄褐色为缺少生活力的花粉，统计花粉中红色花粉数及蓝色花粉数，计算花粉活力=蓝色花粉数/（蓝色花粉+红色花粉），即活力花粉占总花粉数的比例。测定开花前的花粉是否具有活力，开花以后每天测定花粉活力1次，直至花朵凋谢为止。 柱头可授性 材料及试剂： 每类标记20个花序，联苯胺+过氧化氢反应