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免 疫 印 迹(Immunoblot / Western blot) 瞿少刚 sgq9528@ 基础医学院免疫学教研室 免 疫 印 迹(immunoblot/westernblot) 又称蛋白质印迹 凝胶电泳和固相免疫测定技术结合起来的一种免疫生化技术。 借助特异性抗体鉴定抗原 一、概述 二、基本原理 三、应用 四、基本流程 五、实验步骤 六、常见问题及解决策略 概述 ★印迹技术是上世纪分子生物学领域三大发现之一。它与内切酶的发现和PCR基因扩增技术，给人类生物工程带来了革命性进展。 基本原理 在聚丙烯酰胺凝胶进行蛋白质电泳，条件是阴离子去污剂SDS和还原剂并用，通过加热使蛋白质解离成单个多肽亚基，变性的多肽与SDS结合而去除本身电荷，此复合物在电泳中的迁移率只与多肽的大小相关而与多肽本身所带电荷无关。电泳分离的蛋白经电转印至膜载体上，可被特异的抗体所识别。 ★WB的灵敏度可达到标准的固相放射免疫分析的水平而又无需对靶蛋白进行放射性标记。 ★此方法可检测出1-5ng中等大小的待检蛋白。 1.检测样品中的蛋白。 被测蛋白与抗体的特异性结合以及蛋白质的相对分子量 2.未知抗原与已知蛋白的关系 3.评价新抗体的特性 4.蛋白质酪氨酸残基是否发生磷酸化 5.不能用于检测蛋白质的生化特性、化学修饰或半寿期 基本流程 1.将蛋白质经凝胶电泳按分子量大小不同依次分离 SDS.将分离的组分转印到印迹膜 转印 3.对转印到印迹膜的蛋白成分进行免疫学检测 杂交显色  第一部分：SDS) 将玻璃板洗净擦干(水幕流下)，装好玻璃板，加入ddH2O检查密封性。 2) 按下表配制10％的分离胶，充分混匀后沿隔条边缘缓缓加入，距短板上沿2.5cm左右时停止，先后沿两侧隔条边缘加入少许去离子水覆盖胶面，室温聚合30～60min（37oC水浴箱15～20min ）。 分离胶(8 ml) 浓缩胶 3) 倒去顶层水，用滤纸吸去表面水分，插入梳子。 4) 按下表配制浓缩胶，混匀后用1ml移液器加入，室温聚合30 ～ 60min左右（37oC水浴箱15～20min ）。 SDS作用 SDS 是一种离子性的界面活性剂，它既有强离子性的硫酸根离子，也有疏水性的长碳链。 当 SDS 与蛋白质混合时，它会以其碳链与蛋白质之疏水性氨基酸结合将蛋白质包裹起来，而以硫酸根离子外露与水分子作用。 大多数蛋白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位), SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,变性的多肽与SDS结合并因此而带负电荷,且多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关 因此SDS多肽复合物在聚丙烯酰凝胶电泳中的迁移只与多肽的大小相关。 常见问题 常见问题 两块玻璃板之间灌胶,胶为什么总是不平? 1) 玻璃没有洗干净，应该要洗得非常干净！ 2) 过硫酸铵和TEMED的加量不合适，加量相对较多，凝胶凝固过快也会胶不平，最多按照分子克隆加倍。 3) 加完试剂以后没有很好的摇匀，导致有些部位的聚合剂浓度过高，聚合相对较快造成胶不平。 4) 注意手法，均匀加入。 5) 灌胶后应该用水或者异丁醇压胶面 胶为什么总是漏？ 1） 每次电泳完后，洗净玻璃、胶条和其它附件。 2） 避免玻璃边缘（与胶条接触处）破损，尤其和胶条 接触的地方。 3） 找一块很平的桌面，使两块玻璃底面非常平齐， 底板胶条密封效果才好。 4） 胶条一定要干，跑完电泳后，胶条就放在实验台上 晾着。 5） 下面的胶条注意不要老化。 胶不凝 　1）试剂过期：重新配制 　2）APS,TEMED过少：加倍 (胶脆，后期操作易碎) 　3）试剂pH值不对：重新配制试剂 4) 环境温度过低：25度左右较好。 　 具体步骤 将胶装入电泳仪，加入1×SDS电泳缓冲液（加满电泳槽的上下槽），小心拔出梳子。 样品的处理：30ul小鼠血清(小鼠IgG)＋30ul 2×SDS样品缓冲液，混匀后100℃煮沸3～5min。 用移液器将处理过的样品液加入到孔中，约20ul/孔。 蛋白质样品的制备 快 冷 蛋白酶抑制剂 样品可能出现的问题: 电泳具体步骤： 浓缩胶： 100V 分离胶： 130V接通电源 电泳总时间约2h ■溴酚蓝达到胶的底部时，关掉电源，停止电泳。 不应让溴酚蓝泳出底部 ■考马斯亮蓝染色，脱色(选做) 电泳过程中易出现的问题 缓冲液过稀,跑胶很快,带形很差 SDS浓度过高,结果也不好,因为SDS易引起样品聚集 看不到目的蛋白,可能