基因克隆的技术路线.pptVIP

* 实验操作： 1）RNA提取 2）RNA电泳（分离不同长度RNA) 3）转膜 (形成固相RNA) 4）探针标记（同位素/非同位素） 5）杂交 6）洗膜 7）显影（放射性/酶促反应） * Northern blot 特点： 因为没有扩增过程，Northern blot 的 结果可靠性高。可以确定未知基因的 转录产物（mRNA）长度。 优点： 缺点： 1、操作烦琐 2、使用同位素可能污染环境 3、灵敏度低 4、对RNA质量要求高 * 3、Western blot 标记抗体与固定在膜上的蛋白作用。 根据信号强弱判断蛋白表达强度。 根据信号位置判断蛋白分子量。 标准分子量 蛋白 特异性反应带 * 1）蛋白提取 2）蛋白电泳（分离不同分子量蛋白） 3）转移 4）封闭 5）一抗作用 6）标记二抗（HRP/AP标记）作用 7）显色 实验操作： * Western blot 特点： 优点： 直接检测蛋白质的表达量。 缺点： 灵敏度低 一抗制备难度大，购买价格高 * 氨基酸序列测定 测定N端的10－15个氨基酸 测定C端的5个氨基酸 样品需精制 价格较高 * * Direct selection 直接筛选 Antibotic resistance 抗菌素抗性 Marker rescue selection 借助颜色筛选 In situ hybridization 原位杂交 Immunology selection 免疫筛选 Immunochemistry method 免疫化学 Enzyme immunodetection assay 酶免疫分析 * 质粒载体带有氨苄青霉素抗性基因，在宿主细胞内该抗性基因表达出可水解氨苄青霉素的酶，因而宿主细胞可在含氨苄青霉素的琼脂糖平板上生长。 利用抗生素抗性筛选 * 复制起点 氨苄青霉素抗性基因 * * * 2.利用颜色筛选 插入失活现象 X-gal ：5-溴-4-氯-3-吲哚-B-D-半乳糖苷 * 多克隆位点 半乳糖苷酶的基因内有多克隆位点，酶切插入外源DNA后，该基因无法表达. * * 完整的LacZ基因内，经过改造加入了多克隆位点，但并不影响LacZ基因的表达。 当质粒转化细胞后，完整的LacZ基因表达产物与细菌的有关基因表达产物共同组成有功能的半乳糖苷酶，该酶把无色的X-gal切割成半乳糖和蓝色的5－溴－4－氯－靛蓝，使得菌落呈现蓝色。 * 表示外源基因插入编码半乳糖苷酶的基因区段 * Target gene * * 蓝色菌落 无插入序列 白色菌落 含插入序列 转化菌具有氨苄青霉素抗性，可在 加有氨苄青霉素的平板上生长。 * 使用含Amp+X-Gal的琼脂糖平板筛选克隆，可能出现三种情况。 1 . 载体自身环化，产生蓝色菌落； 2 带有正确插入目的基因序列的菌落，白色菌落。 3 未转化的细胞，不能生长。 * * Blue colonies represent Ampicillin-resistant bacteria that contain pVector and express a functional alpha fragment from an intact LacZ alpha coding sequence. White colonies represent Ampicillin-resistant bacteria that contain pInsert and do not produce LacZ alpha fragment. * * 3. In situ hybridization 原位杂交 生长在琼脂糖平板上的菌落，可定点转移到硝酸纤维素膜上，加入放射性的探针（即带有 放射性的与目的片断互补的核酸片断），与菌落杂交。经洗涤后的膜与X－光胶片作用，挑选出阳性克隆。 * * DNA hybridization ??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? * * * * * 免疫法筛选 外源基因在细胞内表达出的蛋白质，可与特异性的抗体结合。 * 利用抗体筛选 原理 目的基因编码的蛋白质作为抗原，用特异性抗体与之反应，再根据颜色等变化，筛选出菌落。 方法 在琼脂平板上的菌落，转移到尼龙滤膜上，若某菌落带有目的基因，并可表达该目的基因所