用SEREX技从卵巢癌cDNA表达文库中筛选肿瘤抗原基因.pdfVIP

鱼塑三墨型』：兰兰壁壁兰：篓丝i望： 一 ．————!￡二!!!L ● 用SEREX技术从卵巢癌eDNA表达文库中 筛选肿瘤抗原基因 ，——一’ 中文摘要 ／’ (肿瘤抗原的寻找一直是肿瘤免疫学研究中面临的重要课题。Sahin报告的 ofrecombinantcDNA libraries)是从 SEREX方法(Serologicalanalysis expression 体液免疫的角度寻找肿瘤抗原，为寻找肿瘤抗原提供了一种全新的途径。已应 用于许多类型的肿瘤抗原的筛选，并发现了一些新的肿瘤排斥抗原，显示出该 方法具有好的应用前景。7 卵巢癌是临床上常见的恶性肿瘤之一，以发现晚和预后差为特征。目前的 治疗方法主要包括实施手术和化疗，寻找新的更具优势的肿瘤抗原用于其免疫 治疗是急需研究的课题。用SEREX法筛选卵巢癌肿瘤抗原的研究在国外较少。 国内尚无报导。本研究用该方法筛选卵巢癌cDNA表达文库，寻找肿瘤抗原。 SEREX方法包含以下步骤：(1)建立肿瘤的cDNA表达文库，用自体血清 进行免疫筛选；(2)阳性克隆的序列分析：(3)mRNA表达分析；(4)确认新的肿 瘤抗原基因。 本研究用SEREX筛选卵巢癌cDNA表达文库，寻找肿瘤抗原基因。所用 文库由本课题组构建。通过该文库的鉴定，该文库的插入片断平均长度大于lkb， 重组率大于99％，能扩增出特异的基因片断，表明所构建的文库质量较好，可 以用于免疫筛选卜陋一步的研究获得以下结果：(1)筛选阳性克隆。首先，取构 建文库的卵巢癌患者的血清，用大肠杆菌Ecoli Lysate进行吸附，去除血清中非 特异性结合物，以减少筛库中的假阳性。噬菌体铺板密度为3000～4000 pfu／150ram 平板，以1：1000稀释的患者血清进行筛选，共筛选了5×105的噬菌体克隆。经 过三次复筛后，得到27个阳性克隆，分别命名为MY—OVA．1～27。(2)将阳性克 行双酶切确定插入片断长度，酶切结果显示它们基因片断的长度从0．4kb到2kb 不等。对阳性克隆的序列分析，显示MY—OVA．16、17、18和20为同一基因。 兰!塾蔓三型苎兰生型苎差堡i!苎———星二!!!L 选的阳性克隆基因，经序列分析分为三类：1)细胞结构基因，如核糖体蛋白， Sequence 伴侣分子等：2)调节基因，如PAIP．I等；3)未知基因ESTs(Expression 异片断MY．OVA．2 表达外，不表达在其它正常组织和细胞中，仅在某些肿瘤细胞株及肿瘤组织中 表达，这2个ESTs属于一个肿瘤抗原家族(C 标记特异性探针进行Northernblot检测。Northernblot检测的基因表达结果与 of eDNA Amplification 扩增，获得扩增条带。用ECL方法进行SouthemBlot，结果显示通过RACE得 到特异的扩增产物。将PCR扩增产物克隆入PGEM—T测序载体，进行序列分析， 1244bp获得了MY．OVA一23的特异性扩增片断，但该片断未得到延伸。 通过本研究，建立了SEREX方法筛选eDNA表达文库的平台技术以及肿 瘤抗原