细胞生物学第三章精要.ppt

第一节 细胞形态结构的观察方法 一、普通光学显微镜和特殊光学显微镜 A. 标本的制备（Preparation of specimen） B. 分辨率和放大倍数（Resolution and magnification） C. 特殊光学显微镜技术 荧光显微镜技术（fluorescence microscopy） 激光扫描共焦显微镜技术(laser scanning confocal microscope） 荧光漂白恢复技术（fluorescence recovery after photobleaching） 相差显微镜和微分干涉差显微镜（Phase-contrast microscope and Differential-interference microscope） 荧光显微镜（fluorescence microscopy） 激光扫描共焦显微镜 （Laser scanning confocal microscope） A.激光束（光源）经双色镜反射后，通过物镜汇聚到样品某一焦点； B.从焦点发射的荧光（样品一般须经免疫荧光标记）经透镜汇聚成像，被检测器检出； C.通过样品其它部位的激光发出的荧光不会聚焦成像，因而检测器不能检出。 用于活体动态，结构-功能，动态-静态，定位-定量-定性研究等。 荧光漂白恢复技术（FRAP） 可用以证明：一个活细胞它的细胞表面质膜中的一些蛋白是可以作侧向运动的。 相差显微镜和微分干涉差显微镜（Phase-contrast microscope and Differential-interference microscope） 因标本密度不同，光线经过时光波相位发生改变，相位改变代表光波振幅改变，而振幅改变代表光线明暗变化，振幅越大光越亮。 普通光镜染色切片是因染料分布不均，各部分厚薄不均，染料沉积不均，对光波吸收不均，因而改变的是光波波长从而使颜色发生改变。 微分干涉差显微镜——用于观察未染色的玻片标本。 1-2 电子显微镜 光镜分辨极限为0.2um，小于0.2um的微细结构的光波可产生衍射现象，这种光波经过物体时可绕过物体就像无物体经过一样，因此无法用光镜观察。这就需要一种更大分辨率的仪器来观察比0.2um更小的物体的细微结构。 1-2 电子显微镜 电子波长比光波短得多，用电子波代替光波可提高显微镜的分辨力。电镜就是根据这样的原理产生的。 A.电镜与光镜的基本区别 B.电子显微镜分辨率 电子显微技术中的常用度量单位是埃(? =0.1nm)。 电子显微镜的分辨极限是2个埃，相当于金属中相邻两个原子之间的距离。 C.电镜的历史 1938年，Ruska生产出第一台透射电镜。 1935年，法国的卡诺尔提出扫描电镜的设计思想和工作原理。 1942年剑桥大学的马伦首次制成世界第一台扫描电镜。 D.电子显微镜的分类 透射电镜（TEM） 扫描电镜（SEM） 透射电镜 （Transmission electron microscope, TEM） 透射电镜（TEM）——① 成像原理 透射电镜（TEM）——② 标本制备过程 透射电镜（TEM）——③ 提高样品反差的方法 负染法（negative staining） 将病毒、纤维、核糖体或分离的生物大分子样品放于覆有亲水性支持膜的载网上，滴加磷钨酸，样品干燥后重金属盐沉淀于样品周围使样品和背景形成显著的明暗对比，这种只染背景而不染样品的方法叫负染 。 真空镀膜法（metal shadowing） 把铂或钯等重金属接受高温蒸发，金属颗粒以一定倾斜角度喷落在样品表面形成不同厚度的薄膜，膜的厚度反映了样品的表面轮廓，主要观察病毒、噬菌体或大分子的形状。 把标本用液氮超低温冷冻，低温真空中割断，升温使冰升华，细胞内外凡含水多的地方因失水而下陷，膜和其它一些结构显露出来，增强了断面的浮雕效果——蚀刻。 标本蚀刻后以45°喷金，90°喷碳后将组织用腐蚀液溶解掉，只剩下碳-金属膜就是复型。捞于载网上干燥后将复型膜置于透射电镜下观察，可观察蚀刻面所暴露的各种微细结构。 肌动蛋白纤维经冷冻蚀刻复型技术得到的影像。 扫描电镜 （Scanning electron microscope, SEM） 扫描电镜技术（SEM）——成像原理 SEM of the stereocilia projecting from a hair cell in the inner ear of a bullfrog (A) .For comparision, the same structure is shown by differential-interference-contrast