核酸凝胶电泳终.pptVIP

二·聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N，N’一亚甲基双丙烯酰胺(简称Bis)在催化剂过硫酸铵(AP)，N，N，N’，N’ 四甲基乙二胺(TEMED)作用下，聚合交联向成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。 聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将DNA或蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种DNA蛋白质，样品电泳后，就应只分离出一条区带。SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质 SDS复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，只是棒长的函数。这种电泳方法称为SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称SDS—PAGE)。 聚丙烯酰胺凝胶电泳种类 1.变性聚丙烯酰胺凝胶（SDS） 变性聚丙烯酰胺凝胶是分子生物学常用技术之一，是根据寡核苷酸的大小来分离，因此可将全长产物与不完整的短分子分开。电泳时通常每一泳道至少加1mg合成的寡核苷酸，电泳后在紫外灯下定位寡核苷酸条带，将长度正确的寡核苷酸从凝胶上切下。主要用于单链DNA片段的分离或纯化。 用途；放射性DNA探针的分离，DNA测序等。 2.非变性聚丙烯酰胺凝胶（native） 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native)或称为活性电泳是在不加入SDS 和疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于酶的鉴定、同工酶分析和提纯。使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，用于双链DNA片段的分离于纯化。 用途；制备高纯度的DNA片段。 操作步骤 制板 制浓缩胶 电泳槽安装 加样 制分离胶 染色 电泳 固定 剥胶 脱色 观察结果 1.制胶 1）在聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。 2）浓缩胶聚合完成后（30分钟）小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸电极缓冲液。 2.样品制备 取样品加入0.5ml2×SDS凝胶加样缓冲液混匀。 3.加样及电泳 用吸嘴吸取50μl，从加样孔底部缓慢加样。 注意：加样时不得插伤凝胶孔面，不得产生气泡、样品不得溢出加样孔。 4.接电源与电泳 上槽接负极，下槽接正极。调节电压至80V电泳至样品前沿刚好进入分离胶后，把电压提高到120V（凝胶上所加电压为8V/cm），继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1cm（约2—3小时），然后关闭电源，取出插头。 5.剥胶 从电泳装置上卸下玻璃，用水果刀撬开玻璃板。并用刀在紧靠最左边一孔凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。 6.染色与脱色 用考马氏亮蓝染色液对SDS聚丙烯酰胺凝胶进行室温染色1~2小时后，用脱色液在脱色摇床上与脱色3~4次，每次20~30分钟。 注意事项 1.丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤，操作时应避免沾在脸、手等皮肤上。最好戴一次性手套进行操作。 2.过硫酸铵的主要作用是提供自由基引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合反应，故一定要新鲜，贮存过久的过硫酸铵商品不能使用。此外，10 ％过硫酸铵必须现配现用。 3.灌制凝胶时，应避免产生气泡，因为气泡会影响电泳分离效果。 4.刚灌制注分离胶混合溶液后，应在分离胶液面上加1~2cm高得水层，以阻隔空气。胶液面上加水层时要特别小心，缓缓叠加，以免冲坏凝胶的胶面。 5.聚丙烯酰胺凝胶电泳耗时长，电泳过程中产热多，特别是夏天产热更多。顾电泳过程中应安装循环冷却水以带走热量，或在4 冰箱中电泳。 ℃ 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 三·脉冲电场凝胶电泳（PFGE ） 在脉冲电场中，DNA分子的迁移方向随着电场方向的周期性变化而不断改变。在标准的PFGE中，第一个脉冲的电场方向在另一侧成45°夹角。由于琼脂糖凝胶的电场方向、电流大小及作用时间都在交替变化，使得DNA分子能够随时调整其游动方向，以适应凝胶孔隙的无规则变化。与相对分子质量较小的DNA相比，相对分子质量较大的DNA需要更多的脉冲次数来更换其构型和方位，使其按新的方向游动。应用脉冲电场凝胶电泳技术，可成功分离到高达107bp的DNA大分子。 倒转电场系统 垂直交变电场 箝位匀强电场系统 反转电场系统 脉冲电场凝胶电泳类型 脉冲电泳的操作步骤 DNA样品制备 限制酶消化 脉冲 分离、纯化大