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H19.27 Generates: - 5’-单磷酸(盐/酯) - 3’-OH末端 - 3’-单磷酸(盐/酯) - 5’-OH末端 ③ 核酸酶催化核酸的磷酸二酯键水解 (cf. p201~) nucleases: - RNases - DNases cleavage sites (no matter exo-/endo-) palindrome (b) H19.30 - 两类限制性内切酶 (cf. p178) Ⅰ型既可催化宿主DNA的甲基化、又可切割没有甲基化的(外源)DNA Ⅱ型只具有核酸酶活性(无需ATP)，另有单独起甲基化作用的限制性甲基化酶与之配套，催化在同一识别序列处碱基的甲基化 识别序列及方向 ? 限制性内切酶是一类重要的DNA内切酶 A残基在识别位点甲基化 未甲基化的DNA断裂成黏性末端 甲基化酶的 高亲和性底物 自体 外源 (eg. virus) G11.31 ? 蛇毒/牛脾磷酸二酯酶均为(脱氧)核酸外切酶 (cf. Fig. 5-48) 10-36a DNA合成酶作用需要… - 模板 - 引物 - dNTP 生成磷酸二酯键 (cf. p181~) (cf. W34-10) ④ DNA序列可通过双脱氧链终止法测定 10-36c ? 双脱氧链终止法 测定DNA序列 (Frederick Sanger, 1977) NP in Chemistry 1980 缺乏继续反应生成磷酸二酯键的能力 前提 电泳技术已发展至能够区分出仅具有单个核苷酸差异的DNA片段 使同一套 片段的末 端均固定 为同一种 核苷酸 (cf. Fig. 5-25) - 需要限制性内切酶在特定位点切割DNA - 分离出的DNA片段能与作为载体的外源DNA连接 - 有能力鉴别出含有重组DNA的载体克隆 ⑴ 制备外源DNA (eg. insulin gene) ⑵ 在特定位点切割DNA和载体 ⑶ 将外源DNA片段与载体连接 ⑷ 利用载体将重组DNA导入宿主细胞(转化) ⑸ 重组DNA在宿主菌内大量复制 ⑹ 筛选和鉴别含有重组DNA的宿主细胞 Paul Berg于1972年将外源DNA片段插入猴病毒SV40环状DNA分子内而首次获得DNA体外重组 基本前提 一般步骤 常用E. coli的质粒，并以某种抗生素抗性基因标记(例如氨苄青霉素抗性基因) ⑤ 利用特殊修饰酶可以制作重组DNA 1926- ? 应用DNA重组技术合成insulin (1982) key step Kary B. Mullis 1944- NP in Chemistry 1993 for his invention (1985) of the polymerase chain reaction (PCR) method 每一轮循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍，通常扩增倍数可达106 ⑥ DNA聚合酶链反应 PCR - 热变性 95℃, 45~60s (起始5~10 min) - 退火 ~55℃, 1 min - 延伸 72℃, 1 min (最后10 min) 25~30 cycles getting enough target for DNA analysis 复习题 (p85~95) 一、选择 13~15, 17~19, 29, 34~37 二、填空 1~6, 10~12, 17, 19, 20, 24~28, 31, 32 三、名词解释 1, 2, 4, 7~10, 15, 17, 22~25, 27 28, 31, 32, 37, 40 四、判断 1, 2, 10, 11, 13, 15, 24, 30, 31, 39~41 五、问答 1, 3, 23, 27 作 业 1. 试比较DNA与RNA一级结构的异同点 2. 简述核酸变-复性过程及其特点 3. DNA测序常用的双脱氧链终止法依据的原理是什么？ 4. 试比较蛋白质?-螺旋和DNA双螺旋结构中的氢键及其 在稳定这两种结构中的作用 5. 为什么DNA双螺旋结构在碱性条件下会发生部分变性 (局部解链)？请预测该解链区是富含G-C对还是A-T对， 为什么？ 科学界以往认为，生命的物质基础DNA是由五种元素(C, H, O, N, P)构成的四种核苷酸序列。如今(1997-)上海交大邓子新院士团队发现了DNA的第六元素S，其“自我修饰”可能改变遗传特性。通过“基因药物”干扰病菌DNA的“S修饰”，有望对抗癌症和艾滋病等绝症。目前，上海交大已和美国麻省理工学院合作，分析出DNA-S修饰的精细化学结构，该成果已于07.10刊登在权威科学刊物Nature: Chemical Bio