重组腺相关病毒凝血因子Ⅸ基因在人鼠结肠上皮细胞中表达的研究.pdf

摘要 血友病B是～种凝血因子IX(hFIX)基因缺陷引起的单基因出血 性疾病。因hFIX的表达不需要精确地调控，少量提高即可改善患者 的出血症状，已证实有许多细胞能分泌具有生物学活性的hFIX，血 友病B已成为基凶治疗的首选疾病。基因治疗的关键在于载体和靶 细胞。重组腺相关病毒(rAAV)具有安全性好、宿主范围广、转导效率 较高、长期稳定表达、可转导分裂细胞和非分裂细胞的特点，是理想 的基因治疗载休。我国病毒基因工程国家重点试验室制备和纯化的高 滴度rAAV．2／hFIX，已在骨骼肌细胞等多种细胞获得较高表达，成为 本实验选用的载体。 靶细胞的选择对hFIX的表达极其重要，它关系到给药方式。目 前多选择成纤维母细胞、肝细胞或肌细胞为靶细胞，以肌注或门静脉 或肝动脉穿刺的方式，但此两种方式均为有创性，分泌量较低，给药 同时须大量输注凝血因子，花费大，病人依从性差。如果以消化道上 皮细胞作为FIX的靶细胞，则可能实现无创。口服途径的hFIX可能 会被胃液降解，我们设想灌肠途径给药，则可实现无创、吸收面积 大、不受消化酶影响、,J,JL依从性好、由门静脉直接吸收入肝而达到 rAAV-2载体与结肠上皮细 有效的肝脏途径结果。结合人凝血园子IX 胞细胞两者的优势，我们设计以结肠上皮细胞为靶细胞，观察 rAAV-2／hF IX在结肠上皮细胞的转导和表达水平。 目前关于hFIX在结肠上皮细胞中的表达的研究载体限于逆转录 病毒及脂质体，而rAAV／hFIX在结肠上皮细胞中的表达尚未见报道。 结肠上皮细胞是否能成为rAAV介导的血友病B基因治疗的靶细 胞，能否有效表达具有凝血活性的hFIX，还需实验验证。本实验以绿 色荧光蛋I刍(GFP)为报告基因，优化rAAV．2对结肠上皮细胞的转导条 件，在荧光显微镜下观察GFP的表达，计算转染率。而后予rAAV-2／hF 从而为血友病B进一步的动物实验和临床基因治疗奠定基础。 一、rAAv一2／GFP在人／鼠结肠癌细胞中的转移和表达 荧光显微镜下观察不同时间GFP的表达，计算转染率。人结肠癌细胞 l×l 株在MOI 7天的转导效率均有增高，且差异有显著性意义(Po．05)。相同MOI 性差异(PO．05)，相同时间在MOll×105 效率最高，丁酸钠能刺激增强转导效率，提高检测的灵敏度。 I 二、rAA卜2／hF x在人／鼠结肠癌细胞中的转移和表达 rAAV-2／hF 11 (984-4．34)ng·106celll．24hffl， ng·106cell-I 活性与hFIX抗原浓度明显相关。一期法SW480细胞转导组2，7， (8．56土1．56)％， 细胞并表达具有凝血活性的功能蛋白hFIX。 激增强转导效率，提高检测的灵敏度。rAAV-2／hFIX能有效地转导 SW480／C26细胞并表达具有凝血活性的功能蛋白hFIX。 关键词 血友病B，基因治疗，重组腺相关病毒，结肠上皮细胞 IlI Abstract anX-linkedrecessive disorderthatis B(HB)is bleeding Hemophilia causedthe or of factor absence coagulantIX(FIX)．Several by deficiency HB for of makeitanidealcandidate aspects genetherapyapproaches Above iscauseda all，HB genetic