第七章基因的定点诱变.pptVIP

第十章 DNA诱变 突变是研究基因结构与功能的最基本手段。 经典的方法是根据突变体的表型，采用遗传学的方法鉴定相应的基因。 传统的诱变方式 利用能够修饰DNA分子的化学或物理诱变剂处理生物体 射线（紫外线、X射线、γ射线等） 化学诱变剂（亚硝酸、羟胺、EMS、亚硝基胍等） 不足： 生物体的任何基因都可能发生突变，目的基因突变率较低，筛选困难 即使获得期望表型的突变体，无法保证突变确实发生在目的基因上 在基因克隆和核酸测序技术发展之前，无法知道基因中突变的位置和性质 Directed evolution （定向进化或直接进化） 对目的基因人为制造大量突变，然后按照特定的需要和目的，给予选择压力，反复诱变，循环筛选，将满足要求的、适合特定目的的分子筛选出来，获得满足需要的性能改良的蛋白质，从而实现在试管中分子水平的模拟进化。 基因直接进化的步骤 突变 基因突变库的建立 筛选 基因突变库的活体或离体筛选 体外诱变 是对克隆化的DNA进行诱变处理，改变其核苷酸序列，获得突变基因。研究基因的结构与功能的关系，获得所需功能的突变体蛋白质 主要方法有：随机诱变，DNA体外重组，寡核苷酸介导的定点诱变，嵌套缺失 第一节 随机诱变 随机的在克隆化DNA中引入碱基置换突变，引入位置和性质均为随机性的。 包括：1.错误掺入诱变（易错PCR) 2.盒式诱变 3.增变菌株的诱变作用 4.化学诱变 随机突变的策略： 1. 易错PCR（error-prone PCR） 在扩增目的基因的过程中，通过改变PCR反应的条件（如改变4种dNTP的比例、改变Mg2+的浓度等），在PCR过程中引入碱基错配，导致目的基因的随机突变 2. 盒式诱变 Cassette mutagenesis 利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒，取代野生型基因中的相应序列 包括两种方式： 盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变 混合寡核苷酸诱变 用于取代的是含有随机突变的混合双联寡核苷酸，可引入大量的随机突变。 在合成寡核苷酸片段时，需要带限制性内切酶位点，以便介导它们互为引物 3增变菌株的诱变作用 因为DNA复制酶有校正功能及DNA复制后修复系统，正常大肠杆菌自发突变频率较小。 与校正和修复有关的基因突变后细胞内基因突变频率大大增加，这样的菌株叫突变菌株。 流程： 把携带待突变基因的质粒转入增变菌株扩增，------随机突变体库。 把该库的重组质粒转化到正常宿主中，筛选鉴定突变体。 4 化学诱变 化学诱变剂（亚硝酸、羟胺、EMS（甲基磺酸乙酯）、亚硝基胍等）处理DNA片段，产生随机突变体库。 DNA体外重组 依赖序列同源性的DNA体外重组，包括DNA洗牌(DNA shuffing)，交错延伸（StEP)，随机引发重组（RPR). 2. DNA shuffling （DNA 重排或改组） DNA shuffling 是指DNA分子的体外重组,是基因在分子水平上进行有性重组。通过改变单个基因（或基因家族）原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能 基本步骤: 目的基因片段的准备：根据不同的需要选择一个基因或其片段，也可以是几个序列上具有较高同源性的基因 DNaseI酶切：将基因随机切割成约50～100bp左右的小片段 不加引物的PCR：在Taq酶的作用下将切割后的DNA重叠小片段重新连接起来，在这个过程中可能发生许多突变和重组 加引物的PCR：加入目的基因片段两端的引物, 使连接好的DNA得到扩增，筛选正突变。 交错延伸重组 图10-5 以两个以上的有一定同源性的DNA片段为模板进行PCR反应，通过交换模板机制实现DNA序列的重新组装。 不需要DNaseI切割DNA，简化了程序。 随机引发重组 图10-6 用一套随机引物与模板配对延伸，产生不同位点的短DNA片段混合物（含有少量点突变），以这些短DNA片段为引物重新组装成全长基因。 寡核苷酸介导的定点诱变 ①基本原理： 使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片段作为引物，启动单链DNA分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物便成为了新合成DNA子链的一个组成部分，因此所产生出来的新链便具有已发生突变的碱基序列 作为诱变剂的寡核苷酸序列： 人工合成一段寡核苷酸序列，该序列中除了所需的碱基突变外，其余的则与目的基因编码链的特定区段完全互补 错配碱基的位置应设计在寡核苷酸分子的中央部位，每侧至少10-15个碱基 通常采用化学合成 无回