第二章DNA重组克隆的单元操作第五周.ppt

第二章 DNA重组克隆的单元操作 2.4.2 基于克隆片段序列的筛选与鉴定 2.4.2.2 菌落原位杂交法 操作过程：噬菌斑→原位影印→标记好的探针与膜杂交→置X光片放射自显影→曝光→有信号的可能为阳性克隆。 原理：依赖探针DNA与目标DNA之间的互补配对 2.4.2 基于克隆片段序列的筛选与鉴定 2.4.2.1 PCR鉴定 重组子和非重组子、期望重组子和非期望重组子 按照标记物，可将探针分为两种： 放射性探针（放射自显影方法进行检测） 非放射性探针 生物素：将生物素偶联在单脱氧核糖核苷酸分子上，合成探针，用偶联了荧光标记的抗生物素的蛋白进行检测 辣根过氧化物酶：用化学发光方法，通过感光胶片和显影技术来进行检测 探针标记的方法 随机引物方法 5-磷酸标记法 反转录标记法（PCR标记） 缺口平移标记 ABC标记 探针的种类 基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针 用于编码特定表达产物的基因的寡核苷酸探针 某些基因编码的蛋白质的性质已知 通过氨基酸序列反推核苷酸序列 TGG-GAT/C-GAA/G-AAT/C-AAT/C-ATG 进行至少两轮的筛选才能获得阳性的克隆 探针的来源-同源序列 用不同来源的DNA分子制备成探针进行检测。 如：用来自鼠的基因A去检测人类中基因A 或基因家族中成员A去检测成员B 2.4.2 基于克隆片段序列的筛选与鉴定 2.4.2.3 限制性酶切图谱法 提取转化子质粒→内切酶进行酶切，电泳 p63 2.4.2 基于克隆片段序列的筛选与鉴定 2.4.2.4 亚克隆法 从一个克隆的DNA片段上分割几个区域，分别将之再次克隆在新的载体上(动词）。 再次克隆过程中得到的无性繁殖菌落，每个亚克隆都含有一种新的重组分子 问题1：不清楚基因的酶切图谱，酶切位点在基因内部，阳性克隆只含有基因的一部分。 问题2：如果酶切位点位于探针杂交区域内部，会出现两个杂交阳性信号。 解决上述问题：重新选择合适酶切位点或进行遗传表型筛选 问题3：降解期望重组子末端非必须序列：Bal31酶降解。 2.4.2.5 DNA序列测定法 A、链终止法测序（p66) B、自动化测序 C、非常规DNA测序（焦磷酸测序，芯片测序等） 链终止法测序—技术路线与要求 制备单链模板 ↓ 将单链模板与一小段引物退火 ↓ 加入DNA多聚酶 4种脱氧核苷酸 分别加入少量4种双脱氧核苷酸 ↓ 将4种反应产物分别在4条泳道电泳 ↓ 根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列 B、自动测序 B、自动测序 基本原理 与链终止法测序原理相同,只是用不同的荧光色彩标记ddNTP,如ddATP标记红色荧光,ddCTP标记蓝色荧光, ddGTP标记黄色荧光, ddTTP标记绿色荧光.由于每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色,而简化为由1个泳道同时判读4种碱基. 制备单链模板 ↓ 将单链模板与一小段引物退火 ↓ 加入DNA多聚酶（4种脱氧核苷酸） 分别加入少量4种荧光标记的双脱氧核苷酸 ↓ 将产物在一个泳道上电泳，根据不同片段的荧光信号判读序列 3、非常规DNA测序（焦磷酸测序，芯片测序等） A、焦磷酸测序 原理：DNA 聚合酶在一种dNTP的存在下进行引物延伸反应,而引物的成功延伸将伴随焦磷酸的释放,焦磷酸在荧光素酶的存在下能引发一种化学发光反应,通过发光计的实时监测来达到检测的目的。 反应底物：adenosine 5′ phosphosulfate (APS，腺苷酰硫酸)、荧光素(luciferin) 反应所需酶： DNA 聚合酶 ATP 硫酸化酶(ATP sulfurylase)：催化APS和PPi形成ATP 荧光素酶(luciferase)：在ATP介导下催化荧光素形成氧化荧光素（可发光） 双磷酸酶( apyrase)：催化ATP和未掺入的dNTP的降解，淬灭光信号 焦磷酸测序流程图 3、非常规DNA测序（焦磷酸测序，芯片测序等） B、基于焦磷酸测序的新一代测序技术（以Roche 454为代表） (1)测序文库的构建。 将待测样品的DNA 用物理方法打碎成300~800 bp的片段，然后在碎片两端分别加上生物素锚定接头。 (2)乳滴PCR。 将带有接头的成百上千条DNA 片段，分别结合到一个磁珠上，磁珠被单个油水混合小滴包被后，在这个小滴内进行独立扩增，没有其他的竞争性或污染性的序列影响，所有的DNA 片段都能平行扩增。待测样品在磁珠上经过孵育PCR，每一个磁珠表面将获得大于一百万倍的原始DNA 片段的拷贝，以达到测序