第五章分子生物学研究方法(上)1详解.ppt

* * 一、DNA甲基化 * * 5’ 3’ CpG岛主要处于基因5’端调控区域。 启动子区域的CpG岛一般是非甲基化状态的，其非甲基化状态对相关基因的转录是必须的。 目前认为基因调控元件（如启动子）的CpG岛中发生5mC修饰会在空间上阻碍转录因子复合物与DNA的结合。因而DNA甲基化一般与基因沉默相关联。 Rb基因 CpG 频率 * * 一、DNA甲基化 * DNA甲基化(DNA methylation)是研究得最清楚、 也是最重要的表观遗传修饰形式，主要是基因组 DNA上的胞嘧啶第5位碳原子和甲基间的共价结合，胞嘧啶由此被修饰为5甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)。 DNMT1 SAM 胞嘧啶 5-甲基胞嘧啶 胞嘧啶甲基化反应 * S-腺苷甲硫氨酸 DNA的甲基化修饰，指CpG二核昔酸中胞嘧啶的5 位碳原子加上一个甲基基团，形成5 甲基胞嘧啶。由于甲基基团很小，对其研究具有一定的难度。一般而言，可以分辨出甲基化修饰的方法有以下几种： a、甲基化敏感性内切酶； b、亚硫酸氢盐的修饰； c、特异性识别甲基化修饰DNA的抗体或蛋白； d、质谱或色谱等精密检测手段。 由于受到仪器等条件的制约，应用比较广泛的是前三种方法。 DNA nucleotides, the building blocks for the new DNA Template DNA, the DNA sequence that you want to amplify Primers, single-stranded DNAs between 18 and 30 nucleotides long (oligonucleotides) that are complementary to a short region on either side of the template DNA DNA polymerase, a heat stable enzyme that drives, or catalyzes, the synthesis of new DNA * PCR的基本反应步骤 变性 95?C 延伸 72?C 退火 Tm-65?C PCR扩增能力是十分惊人的，经n次扩增后, 一个DNA分子可变为2n个DNA分子。 理论上讲经过30次循环反应，便可使靶DNA得到109倍的扩增，但实际上大约是106～ 107倍的扩增，即便反应混合物中只含有一个拷贝的靶DNA，也能被有效的扩增，因此可用于痕量DNA样品的分析，这对于法医学具有特别的应用价值。 PCR仪 PCR 琼脂糖凝胶电泳 最终产物 紫外光观察 PCR的基本步骤 设计一对引物以便有效扩增所需要的DNA序列。 优化反应体系：缓冲液、待扩增的模板、dNTP 、Mg2+ 、引物、耐热DNA聚合酶。 变性（denaturation ）、退火(annealling) 、延伸(extension)三部曲：在PCR仪上进行。 PCR产物的检测：琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外光下检测。 PCR的原理 PCR应用 基因克隆、 基因序列分析、 遗传病诊断、 古生物学研究 以及刑侦破案、亲子鉴定等诸多方面。 * Reverse transcriptase (RT)-PCR AAA(A)n 5‘-Cap mRNA (dT)12~18 primer anneal 5‘-Cap AAA(A)n 3‘ 5‘ Reverse transcription dNTP, RT 5‘-Cap AAA(A)n 5‘ cDNA:mRNA hybrid Regular PCR 5·2 DNA基本操作技术 5.2.1 凝胶电泳(gel electrophoresis) 5·2·2 细菌转化 5.2.3 PCR技术 5.2.4 实时定量PCR 5.2.5 基因组DNA文库构建 5.2.4实时定量PCR 实时定量PCR(real-time quantitative PCR, Q-PCR), 90年代末期出现了Q-PCR. 未知模板进行定量分析? 未知模板进行定量分析 在常规PCR基础上添加了荧光染料或荧光探针，只有与DNA结合后才能被激发出荧光。在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法,实现对起始模板定量及定性的分析。 从而消除了在测定终端产物丰度时有较大变异系数的问题。 非特异性荧光染料标记： 1、 SYBR Green 特异性荧光探针标记： 2、TaqMan 3、Molecular