第四章分子生物学研究技术详解.ppt

第四章 分子生物学操作技术 4.1 凝胶电泳技术 4.2 核酸的提取和纯化 4.3 DNA测序技术 4.4 PCR技术 4.5 核酸分子杂交 4.6 重组DNA技术 琼脂糖由红色海藻产物琼脂提取，将琼脂糖粉末加入TBE熔解后冷却凝固即成凝胶。 其分辨能力和浓度有关：浓度低，能够分辨大片段DNA；浓度高，能够分辨小片段（几百bp）DNA。 通过EB染料染色DNA来检测凝胶中DNA谱带部位。 EB（溴化乙锭）是一种扁平分子的嵌入性染料，能插入到DNA分子的相邻碱基之间，并在300nm紫外线照射下发出荧光(肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带)。 琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2~50kb之间。 3 基因组DNA、RNA、质粒DNA的提取纯化3.1 基因组DNA的提取和纯化 基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。 提取方法： 核酸从cell中释放出来的方式：①研磨 ②超声波 ③匀浆 ④冻溶 ⑤溶菌酶 加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中, 可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部, 从而达到提取的目的。 注意事项： （1）在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的DNA。 （2）一般来说,构建基因组文库, 初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析, DNA长度可短至50kb, 在该长度以上,可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下),并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。 （3）不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。 （4）在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时, 应考虑除去多糖和酚类物质。 提取步骤（以植物为例） 在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ, 60℃水浴预热。 植物幼苗或叶子5-10g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高), 不时摇动。 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混匀(需带手套, 防止损伤皮肤)，室温下静置5-10分钟, 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。 室温下5000rpm离心5分钟。 仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。 在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转入含TE的离心管中,DNA很快溶解于TE。 如DNA不形成絮状沉淀,则可用5000rpm离心5分钟, 再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60℃水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。  将DNA溶液3000rpm离心5分钟, 上清液倒入干净的5ml离心管。 加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃ 10分钟, 除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。 加入1/10体积的3mol/L NaAc及2×体积的冰乙醇,混匀,-20℃放置20分钟左右,DNA形成絮状沉淀。 用玻棒捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。 将DNA重新溶解于1ml TE, -20贮存。 3.2 RNA（mRNA）提取和纯化 ㈠ 关键因素：抑制RNA酶的活性 ㈡ 两条途径： ①提取多聚核糖体，利用抗原抗体反应，得到mRNA ②提取总RNA Oligo(dT)-纤维柱层析 将mRNA与其它RNA分开 ㈢ 注意事项①器皿都要严格消毒 ???????????②要加RNA酶的抑制剂(焦碳酸二乙酯)(DE