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第六章 分子杂交技术 第一节 探针的选择和标记 第二节 杂交和洗膜 第三节 检测与分析 1、原理 碱基互补配对 探针（probe） 同特异性目标作用 有效检测 2、基本步骤 探针的选择和标记 转膜 预杂交、杂交 洗膜 检测 第一节 探针的选择和标记 1、克隆探针和合成的寡核苷酸探针 特异性 灵敏度 杂交时间 2、寡核苷酸探针的类型和应用 特定序列的单一寡核苷酸探针 较短而简并性较高的成套的寡核苷酸探针 对少量高度纯化的蛋白质进行测序；按照遗传密码推导 较长而简并性较低的寡核苷酸探针 ①只含有所有可能密码中的一部分 ②简并位点上带上一个“中性”碱基，如次黄苷酸 例：根据氨基酸序列选择长17个核苷酸的寡核苷 酸探针 数目 2×2 ×2×4=32 3、寡核苷酸探针的选择原则 长度18-50bp G、C碱基组成在40%-60% 分子内不存在互补区 避免在序列中连续出现一个碱基的多次重复 4、探针的标记方法 双链DNA探针的制备 切口平移；随机引物（光盘） 使用前变性；杂交过程中可能发生自退火 单链DNA探针的制备 在单链模板上进行引物延伸反应；化学合成；PCR 单链RNA探针的制备 双链DNA的切口平移标记法 DNA的随机引物标记法 back 酶切位点要选择在 正好处于插入的 目标DNA的下游 使转录产物 不含载体序列 利用体外转录体系产生单链RNA探针 5、标记物的选择 放射性同位素 非放射性同位素 地高辛（Digoxigenin）-11-dUTP的结构 第二节 杂交和洗膜 1、杂交的速率与探针长度及复杂性 示t1/2和杂交探针长度之间的关系 2、杂交的最适条件 杂交分子的稳定性 温度 杂交的严紧性 高温/低盐 第三节 检测与分析 非放射性DNA标记和检测程序 例：转基因植物的检测 抗生素筛选、PCR、Southern、Northern、Western 双酶切检测 单酶切检测 R0代转化子的Southern分析 转化子R1后代的Southern分析 如何判断插入拷贝数？ ①与含有不同拷贝数（1、5、10）的质粒杂交结果做对照 ②通过多个单酶切结果判断 通过选择酶切位点和探针位置，可进行comprehensive杂交，以判断外源插入片段是否串联排列，以及排列方向 原位杂交（in situ hybridization，ISH） 利用含有互补序列的DNA或RNA探针直接检测在染色体、细胞或组织内特定DNA或RNA序列的技术 广泛应用于检测染色体的结构变异、外源染色体的渗入和转基因的分子细胞遗传学鉴定等 荧光原位杂交 （fluorescence in situ hybridization，FISH） 习题1 某人在做Southern杂交时，为节省时间，完成凝胶电泳后，未经NaOH溶液浸泡凝胶，就直接将DNA从凝胶转至硝酸纤维素膜上，然后应用标记探针杂交，结果发现放射自显影后胶片上一片空白。请问应如何解释这一结果。 习题2 2个正常个体生育一个患有唐氏综合症（21号染色体三体）的病儿，利用1段21号染色体探针，应用RFLP技术分别分析三个个体，凝胶分析结果如图示，根据这个结果，请分析病儿21号染色体的来源，并简述理由。