人类基因组DNA提取教案.ppt

人类基因组DNA提取、限制性核酸内切酶切割的原理、方法、琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用 人类基因组DNA的提取 提取方法: 1·从全血中提取 2·从口腔上皮脱落细胞，发根细胞中提取 (全血）原理： 细胞裂解液 ：裂解细胞膜，收集细胞核 SDS：破裂核膜 蛋白酶K：使核蛋白降解成小片段并从DNA上解离 下来 苯酚﹑氯仿：抽提去除蛋白质 无水乙醇：沉淀DNA 75%乙醇：洗涤DNA沉淀 真空干燥后，溶解于TE中即得到高分量的DNA （全血）操作方法： 细胞裂解与RNase/蛋白酶K 消化 　　1. 取100 μl抗凝全血置于1.5ml Eppendorf离心管中，再加入100 μl裂解液和20 μl RNaseA/蛋白酶K液，用移液器来回吹打混匀，室于55℃温浴35分钟，其间来回颠倒离心管几次，直至溶液呈水溶状。 　　2. 加入10μl 3M的NaAc(pH 4.8)，随后加入1250 μl结合缓冲液，充分振荡混匀，12，000 rpm离心30秒。 DNA与吸附柱结合 　　3．用移液器Tip转移上清并加入到离心吸附柱（套好收集管）中，放置1分钟，12，000 rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。 　　注意：待转移上清约1300μl，离心吸附柱容量约650 μl，故需每次转移上清650 μl到离心吸附柱中，离心，倒掉收集管中的废液，重复实验操作步骤3。 DNA的纯化: 4. 再加入600 μl洗涤缓冲液（washing buffer）到离心吸附柱（套好收集管）中，12，000 rpm 离心30秒。 　　5．重复步骤4一次，12，000 rpm 离心3分钟以充分除去洗涤缓冲液。 　6．小心取出离心吸附柱，弃收集管，将离心吸附柱套入一个干净的1.5ml Eppendorf 离心管，并加入50 μl洗脱缓冲液(elution buffer) 到离心吸附柱中(洗脱缓冲液一定要加在离心吸附柱的正中)，放置1分钟，于12，000 rpm 离心30秒。 　　7．取出Eppendorf 离心管，其中便是所提取基因组NA。 （口腔上皮脱落细胞）原理 哺乳动物的一切有核细胞都可以用来制备DNA,除特殊要求外，白细胞，肝或脾组织是最常用的的材料。原始材料较少或较难获得时（如羊水细胞），还必须经过细胞培养来获得足够量的细胞，有时为了简易，还可以无创伤的采集材料，如用口腔上皮脱落细胞，发根细胞。产前诊断所用的材料则为胎儿的羊水细胞或绒毛膜细胞； （口腔上皮脱落细胞）操作方法： 1、用舌头舔颊粘膜上颚、用牙刮颊部，嘬咀，用分泌出的唾液反复漱口；将唾液吐到杯中。用生理盐水洗涤，2000rpm离心10分钟，倒掉上清液；重复1次。 2、沉淀中加1ml 1×细胞核裂解液(STE)，打散细胞团、混匀，再加酶解混合液（含350μl STE、150μl 10% SDS和10μl 20mg/ml蛋白酶K），摇匀，至出现粘稠透明状。37℃温箱过夜或50℃3~4小时。 3、加等体积饱和酚（或1/3体积的饱和NaCl），轻摇混匀10分钟，室温2000rpm离心10分钟，去除蛋白和SDS的沉淀。 4、小心移上清至另一离心管（尽量避免吸取中间层），加等体积氯仿混匀5分钟，室温2000rpm离心5分钟。 5、重复步骤4一次。 6、将上清移入另一离心管中，沿离心管壁向DNA溶液中加入2.5倍体积的无水乙醇，轻轻摇动离心管混和至体系完全均一，见白色絮状DNA。用移液器吸头挑出DNA沉淀，在新配制的70%乙醇洗二次，室温干燥5分钟，再将DNA溶于20-100μl TE中。 7、TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置-70℃保存。 限制性核酸内切酶 一、概念 二、分类 分类依据：酶的基因、蛋白质结构、依赖的辅助因子及与DNA结合和裂解的特异性 三、作用机制 以环状或线性的双链DNA为底物，在合适的反应条件下，识别特定的核苷酸序列，使两条核苷酸糖链上特定位置的磷酸二酯键断裂，两裂口之间的碱基对的氢键也随之断开，产生具有3’-羟基和5‘-磷酸基的DNA片段。 四、切割方法 识别和切割位点 4-6个碱基对且具有回文序列的DNA片段 大多数酶是错位切割产生5’或者3‘黏性末端 例如： EcoR I 切割后产生5’黏性末端 5‘-G↓AATTC-3’ 5‘-G AATTC-3 3’-CTTAA↑G-5 3‘-CTTAA G-5 同工异源酶 来源不同的酶，但能识别和切割同一位点 如BamH I 和Bst I(G↓GATCC) 同尾酶 有些限制性内切酶识别序列不同，但是产