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PCR（多聚酶链式反应） 、 实验原理 PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段，即通过引物延伸而进行的重复双向DNA合成。基本原理及过程如下： PCR循环过程中有三种不同的事件发生：（1）模板变性；（2）引物退火；（3）热稳定DNA聚合酶进行DNA合成。 1变性：加热使模板DNA在高温下（94-95℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。 2退火：在体系温度降至37-65℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，使引物与模板链3’端结合，形成部分双链DNA，即退火阶段。 3延伸：体系反应温度升至中温72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5’到3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。 上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍。 典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成的DNA引物、耐热DNA Taq聚合酶。 按下列组份配制 PCR 反应液 TaKaRa LA Taq（5 U/μl） 0.5 μl 10×LA PCR Buffer II（Mg2+ Plus） 5 μl dNTP Mixture（各 2.5 mM） 8 μl 模板 DNA（λDNA）* 2.5 ng 引物 1（10 μM） 2 μl 引物 2（10 μM） 2 μl 灭菌蒸馏水 up to 50 μl *【50 μl PCR 反应体系中模板 DNA 推荐使用量】 人基因组 DNA 0.1 μg～1 μg 大肠杆菌基因组 DNA 10 ng～100 ng λDNA 0.5 ng～5 ng 质粒 DNA 0.1 ng～10 ng PCR 反应条件。 以λDNA 为模板，扩增 1 kbp、35 kbp 的 DNA片段的 PCR 反应条件如下： 【1 kbp】 95℃ 5 min. 95℃ 30 sec. 55℃ 30 sec. 35 Cycles 72℃ 1 min. 72℃ 10 min. 【35 kbp】 94℃ 5 min. 98℃ 10 sec. 68℃ 15 min. 35 Cycles 72℃ 10 min. 常用循环： 95℃ 5 min. 95℃ 45 sec. 55℃ 45 sec. 35 Cycles 72℃ 2 min. 72℃ 10 min. 四、可能出现的问题与解决方案： 假阴性，不出现扩增条带　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量，④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。　　模板：①模板中含有Taq酶抑制剂，②在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。③模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，有可能是模板核酸提取过程出了毛病，可使用阳性对照的DNA模板配合检查模板质量。　　酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。　　引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏，导致引物变