多聚酶链式反应扩增DNA片断课件.pptVIP

* * 专题5 DNA和蛋白质技术 湖南邵东三中 杨连进 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片断 一、基础知识 （一）DNA分子的结构 C、H、O、N、P 1、组成元素 脱氧核苷酸 2、基本单位 3、脱氧核苷酸结构 一个核苷酸上的磷酸基团上的“－OH”和另一个核苷酸分子的第三位碳原子上的羟基之间失去一分子水，形成磷酸二脂键，即在相邻的两个脱氧核苷酸的3’和5’碳原子之间形成磷酸二脂键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3’、5’、磷酸二脂键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将DNA的羟基“－OH”末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端 4、多脱氧核苷酸链得形成 脱氧核苷酸结构式 O O P O HO 碱基 O OH O O P O HO OH 碱基 5’ 3’ 3’ 5’ 碱基 脱氧核糖 磷酸基团 碱基 脱氧核糖 碱基 脱氧核糖 5’ 3’ 多脱氧核苷酸链结构简图 5、DNA分子的双螺旋结构 ① DNA分子是由两条反向平行的（即一条链为3’－5’，另一条链为5’ －3’ ）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则双螺旋结构 ②脱氧核糖与磷酸交替连结，排列在外侧，构成基本骨架；碱基排列在链的内侧 ③两条链上的碱基通过氢键连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤一定与胸腺嘧啶配对，鸟嘌呤一定同胞嘧啶配对 （三）DNA的复制 2、时期 有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期 3、场所 细胞核（主）、线粒体、叶绿体 4、模板 DNA母链 1、概念 由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程 5、原材料 脱氧核苷酸 6、基本条件 酶、ATP、原料、模板 7、复制过程 ① DNA的解旋 亲代DNA分子利用细胞提供的能量在解旋酶的作用下氢键断裂，部分双螺旋链解旋为两条平行的双链 ② RNA引物的合成 以单股DNA为模板，在引物酶的作用下合成小段的RNA引物 ③ DNA的生成 以单股的DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下，在RNA引物的末端由5’端－3’端合成DNA。 ④切掉引物生成冈崎片断 在核酸酶的作用下切掉引物。在DNA聚合酶的作用下将引物部位换上DNA，此时的DNA片断称为冈崎片断 ⑤ DNA片断的连接 在DNA连接酶的作用下将冈崎片断连接起来。形成一条完整的新的DNA链。新链与旧链构成新的DNA 边解旋边复制(过程） 8、复制特点 半保留复制（结果） 9、遵循原则 碱基互补配对原则 10、精确复制的原因 11、复制的意义 DNA分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后代，从而保持了遗传信息的连续性 ①规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板 ②碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行 （四） PCR(多聚酶链式反应） 1、 DNA聚合酶特性 不能从头合成DNA，只能从DNA的3′端开始延伸DNA链，因此， DNA复制需要引物 2、 DNA聚合酶作用过程 当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后， DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链， DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸 3、 PCR原理 ①在80－100°C的温度范围内， DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性 ②当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链 ③ PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器 高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的Taq DNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化 4、 Taq DNA聚合酶的应用 5、 缓冲液需要为PCR反应提供的物质 DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行 PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出 6、 PCR技术的特点 7、细胞内和细胞外DNA复制环境的区别 体内DNA的复制 体外的模拟 模板（母链） 细胞内源 外源加入 引物 引物合成酶 外源加入 原料 细胞内源 外源加入 聚合酶 细胞内源 外源加入 反应环境 细胞内环境 缓冲液 ① PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为20－30个脱氧核苷酸 8、细胞内复制和PCR不同点 ② PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的 *