05第七章代谢控制育种【4学时】解析.ppt

实例2：色氨酸对杀假丝菌素生物合成的反馈调节 3.4 次级代谢反馈调节 2. 分支代谢初级代谢物反馈调节对次级代谢的影响 (1) 次级途径和初级途径具有共同的分叉中间体 (2) 初级代谢终产物作为前体合成次生产物。 实例：缬氨酸对青霉素生物合成的反馈调节 3.4 次级代谢反馈调节 2. 分支代谢初级代谢物反馈调节对次级代谢的影响 在抗生素发酵中，加入前体可显著增产，但前体加入超过一定限度，将产生毒性。 3.4 次级代谢反馈调节 2. 分支代谢初级代谢物反馈调节对次级代谢的影响 (2) 初级代谢终产物作为前体合成次生产物。 1.磷酸盐的亚适量: 已发现过量磷酸盐对四环素、氨基糖苷类和多烯大环内酯类等32种抗生素的生物合成产生阻抑作用。所以，在工业生产中，磷酸盐常常被控制在适合菌体生长的浓度以下，即所谓的亚适量。 2. 磷酸盐调节抗生素的生物合成的机制 按效应来说，有直接作用和间接效应； 具体而言，磷酸盐能影响抗生素合成中磷酸酯酶和前体形成过程中某种酶的活性；ATP直接影响某些抗生素合成和糖代谢中某些酶的活性。 3.5 磷酸盐调节 如果细胞膜对某种物质不能运输或者运输功能发生障碍，其结果是： 一方面，细胞内合成代谢的产物不能分泌到胞外，必然会产生反馈调节作用，影响发酵产物的生产量； 另一方面，细胞外的营养物质不能进入细胞内，从而影响产物的合成，造成产量下降。 3.6 细胞膜透性的调节 第四节 代谢调节控制育种 p.171 代谢调节控制育种通过特定突变型的选育，达到改变代谢通路、降低支路代谢终产物的产生或切断支路代谢途径及提高细胞膜的透性，使代谢流向目的产物积累方向进行。 代谢控制发酵：将微生物通过人工诱变，获得代谢发生改变的突变株，在控制条件下，选择性地大量生产某种人们所需要的产品。 抗反馈调节突变株选育 1. 概念：指操纵基因或调节基因突变引起酶合成诱导机制失灵，菌株不经诱导也能合成酶、或不受终产物阻遏的调节突变型。 调节基因突变，致使不能形成活性化的阻抑物； 操纵基因突变，丧失和阻抑物结合的亲和力。 因此，可以利用一些易同化碳源或价廉易得的碳源作为基质生产所需的诱导酶类。 2. 筛选方法及实例 (1) 限量诱导物恒化培养 (2) 循环培养 (3) 鉴别性培养基的利用 (4) 筛选 4.1 组成型突变株的选育 (1) 限量诱导物恒化培养 将野生型菌种经诱变后移接到低浓度诱导物的恒化器中连续培养 由于底物浓度低到对野生型不发生诱导作用，所以诱导型的野生菌不能生长 突变株由于不经诱导即可产生诱导酶而利用底物，因而得以生长成为组成型菌株 4.1 组成型突变株的选育 2. 筛选方法及实例 (2) 循环培养 含有诱导物 的培养基 不含诱导物 的培养基 交替连续循环培养 由于组成型突变株在两种培养基上都能产酶，生长逐渐占优势 4.1 组成型突变株的选育 2. 筛选方法及实例 (3) 鉴别性培养基的利用 甘油作惟一碳源 涂布诱 变孢子 悬液 喷上O-硝基苯酚-β-D-半乳糖苷 (ONPG) 组成型 诱导型 4.1 组成型突变株的选育 2. 筛选方法及实例 (4) 筛选 经诱变剂处理后的菌体移接到含有诱导能力低，但能作为良好碳源的诱导物的培养基中培养，突变体能良好生长，野生型不能生长。 例如：利用苯-β-半乳糖(PG)筛选β-半乳糖苷酶组成型突变株。 4.1 组成型突变株的选育 2. 筛选方法及实例 概念：抗分解阻遏和抗分解抑制的突变株。 分解代谢阻遏现象：在初级或次级代谢中都存在，其含义是指代谢过程中酶的合成往往受高浓度的葡萄糖或其他易分解利用的碳源或氮源所抑制。 选育抗分解调节突变株(如碳源、氮源或磷酸盐分解调节)，其实就是筛选合成酶的产生不受碳、氮、磷的代谢阻遏或抑制的突变株，使抗生素提前到菌体生长期开始合成，延长产抗期以提高产量。 4.2 抗分解调节突变株的选育 筛选此类突变株的目的 由于葡萄糖分解产物的积累，阻遏抗生素合成的关键酶，从而抑制抗生素的合成。在实际生产中，采用流加葡萄糖或应用混合碳源可以控制分解中间产物的累积来减少不利影响，但最根本的办法则是筛选抗碳源分解调节突变株，以解除上述调节机制，达到增产的目的。 筛选方法与实例 (1) 循环培养法 (2) 鉴别性培养基 (3) 特殊氮源 (4) 葡萄糖结构类似物 4.2 抗分解调节突变株的选育 1. 解除碳源调节突变株的选育 (1) 循环培养法 快速利用的 碳源培养基 慢速利用的 碳源培养基 交替培养 突变型解除了阻遏现象，在乳糖的培养基上比野生型生长速度快， 4.2 抗分解调节突变株的选育 1. 解除碳源调节突变株的选育 (2) 鉴别性培养基 含有葡萄糖的琼脂平板 涂布诱 变后的 菌体 喷上O-硝基苯酚-β-D-半乳糖苷 (ONP