安徽中医药大学药学院革兰氏染色创新.ppt

实验一 细菌形态观察和革兰染色法 微生物实验室的生物安全 微生物实验的对象大多是活的病原微生物，具有感染性，因此必须建立严格的“无菌观念”。严格按照实验操作规程操作，防止在实验过程中造成自身感染和环境污染。 微生物实验室操作规程 一、书包、衣物等不要带入实验室，必要的工具带入后，应放置在远离操作部位处。 二、进入实验室后穿上工作服，离开时脱下，反折。 三、实验室内应保持安静、整洁、有秩序。不得高声谈笑，随便走动，以免影响他人实验。 四、实验室内严禁饮食、吸烟。 五、发生菌液误吸时，应及时报告指导老师，给予处理。 革兰染色（Gram Stain) Gram Stain 是由丹麦病理学家C.Gram于1884年首次使用的细菌染色法，后经过改良并以他的名字命名。 革兰氏染液：结晶紫、卢戈碘液、95％乙醇、稀释石炭酸复红染液 实验目的 1.掌握细菌涂片标本的制备及革兰氏染色法。 2.掌握无菌操作技术。 3.熟悉革兰氏染色法在鉴定细菌上的重要意义。 实验原理 三种假说 1.等电点学说 革兰阳性菌等电点（pI ：PH 2-3）比革兰阴性菌（pI： PH 4-5）低，在相同pH条件下，革兰阳性菌所带负电荷比革兰阴性菌多，故与带正电荷的结晶紫染料结合牢固，不易脱色。 2. 化学学说 革兰阳性菌菌体含大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫牢固结合，使已着色的细菌不被乙醇脱色；革兰阴性菌菌体含核糖核酸镁盐很少，故易被脱色。 3.通透性学说 革兰阳性菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入；革兰阴性菌细胞壁结构疏，肽聚糖层薄，含大量脂质，乙醇易渗入。 实验材料 菌种：大肠杆菌18～24h琼脂斜面培养物、葡萄球菌18～24h琼脂斜面培养物。 试剂：革兰染色液。 其他：载玻片、生理盐水、接种环、酒精灯等。 实验步骤 细菌涂片标本的制作（涂片、干燥、固定） 染色（初染、媒染、脱色、复染） 镜检 【实验方法】 染色 取洁净的载玻片一张 滴加稀释石炭酸复红染液，30s～1min后水洗，用吸水纸吸干 实验结果 革兰阳性菌被结晶紫着色后不易被酒精脱色，故染成紫色，如葡萄球菌； 革兰阴性菌被结晶紫着色后易被酒精脱色，故被稀释石炭酸复红复染成红色，如大肠杆菌。 葡萄球菌 大肠杆菌 注意事项 1. 标本涂片不能涂的太薄或太厚，以免影响结果。 2. 革兰染色成败的关键在于脱色时间。如脱色过度， 革兰阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰阴性菌；如脱色时间过短，革兰阴性菌也会被认为革兰阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄、脱色时玻片晃动的快慢及乙醇用量多少等因素影响，难以严格规定。 3. 染色过程中勿使染色液干涸，用水冲洗后，应甩去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。 4. 选用培养16～24h菌龄的细菌为宜。若菌龄太老，由于菌体死亡常使革兰阳性菌转呈阴性反应。 细菌特殊结构观察 思考题 影响革兰氏染色的因素有哪些？这些因素对染色有哪些影响？ * * * * * * * 六、用过的吸管、滴管、试管、玻片等应放在指定的污物缸或试管筒内，严禁放在桌面上或水池内。 七、爱护公物、节约使用实验材料，器材如有损坏，应及时报告指导老师，听候处理。 八、实验完毕，整理桌面，将欲培养的物品放在指定地点。值日生打扫卫生，关好水电、门窗，洗手后离室。 意义： 1.革兰染色法可以观察细菌的形态和排列，根据染色结果将所有细菌分成革兰阳性菌与革兰阴性菌两大类：不被酒精脱色仍保留紫色者为革兰阳性菌（G+菌），被酒精脱色后复染成红色者为革兰阴性菌（G-菌）。 2.革兰染色法不仅有助于细菌的鉴别，同时还为分析细菌的致病性 3.选用抗菌药物提供了依据。 涂片 干燥 固定 镜检 初染、媒染、脱色、复染 滴一小滴生理盐水于载玻片中央 接种环在酒精灯火焰上烧灼灭菌、冷却 无菌操作从琼脂斜面上沾取少许菌苔混入载玻片上的生理 盐水中磨匀并涂抹成直径1cm－1.5cm左右的均匀薄层菌膜 自然干燥；或将涂有细菌的一面朝上，在酒精灯火焰上方烘干 手持载玻片一端，涂有细菌标本的一面朝上，将载玻片在酒精灯火焰外层 （最热部分)来回快速通过3次，使涂抹的细菌固定于载玻片上 用油镜观察，并判断菌体的染色反应性。记录实验结果 加95%乙醇数滴于标本片上，频频摇晃3～5s后，斜持玻片使乙醇流掉， 再滴加乙醇直至无紫色脱下为止（约30s），水洗 ，甩去标本片上的积水 滴加卢戈碘液，1min 后水洗，并将标本片上的积水甩净 将玻片置于染色架上，滴加结晶紫染液2～3滴于标本片上（涂片两端同时 进行，以下同）， 1min后水洗，并将标本片上的积水甩净 初染（1min) 媒染(1min) 脱色(30s) 复染(30s) 肺炎链球菌荚膜形态 破伤风芽孢杆菌芽孢形态 普通变