生物技大实 验部分操作程序-易.docVIP

生物技术大实验操作指南 实验一 鸡输卵管总RNA提取（溶菌酶基因的提取） 原理：组织细胞在冰浴中剪碎（最好有液氮），加Trizol快速匀浆碾磨，加一定体积的氯仿振荡，离心，取水相，加等体积的异戊醇（或无水乙醇）沉淀，75%乙醇洗涤，晾干，无RNase的ddH2O溶解。 试剂与设备： TotalRNAExtractor（Trizol）或RNAsimple Total RNA Kit，氯仿，异戊醇，无水乙醇，ddH2O Free RNase。研钵，玻璃匀浆器，16000转低温冷冻离心机。 步骤： 新鲜鸡输卵管膨大部，50mg，预冷的研钵中剪碎，加1ml Trizol冰浴中匀浆，RT 5-10 Min。 加200ul 氯仿，振荡15 Sec，RT 3 Min。 4℃ 12000rpm，离心10Min，吸取上层水相，转入新的离心管。 加500ul 异戊醇柔和混匀，RT沉淀30Min,离心同上，留取沉淀。 加1ml 75%乙醇洗涤沉淀 2次，勿剧烈振荡，离心同上，收取沉淀，RT晾干3-5Min。 50ul ddH2O Free RNase 溶解沉淀。 检测RNA纯度与浓度。 实验二 溶菌酶基因第一链cDNA合成 原理： mRNA经M-MuLV催化，以Oligo dT为引物，将mRNA反转录合成cDNA，此cDNA为单链。 试剂与设备：M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒，恒温水浴锅，掌上离心