第四章 病毒抗原与抗体检测技术.pptVIP

固定病毒稀释血清法 恢复期血清中和病毒的结果 血清 稀释度 CPE孔数/接种孔数 累计数 CPE数 无CPE数 CPE阳性比例 CPE阳性率（％） 1：16(10-1.2) 0/4 0 8 0/8 0.0 1：32(10-1.5) 1/4 1 4 1/5 20.0 1：64(10-1.8) 3/4 4 1 4/5 80.0 1：128(10-2.1) 4/4 8 0 8/8 100.0 固定病毒稀释血清法 距离比例＝（50%—小于50%的CPE阳性率）/ （大于50%的CPE阳性率－小于50%的CPE阳性率） ＝（50－20）/（80－20）＝0.5 50%血清中和终点的范围:1:32与1:64之间。 中和终点浓度=小于50%的CPE阳性率血清稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数=lg10-1.5+0.5 ×lg0.5=-1.65,其反对数是1/45 即50%血清中和终点为1:45 含义：1:45稀释度的恢复期血清可保护50%细胞不产生细胞病变效应。 二、血凝/血抑 血凝 HA 血凝抑制 HI 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 血凝试验 HA 试验方法 选择96孔板（V型） 病毒液倍比稀释 稀释好后加鸡红细胞 混匀后±20℃室温静置30min +50μl PBS 吸出一半 1:2 1:22 1:23 1:24 +100μl 病毒液 +50μl 鸡红细胞 吸弃一半 血凝试验 HA 血凝滴度：以出现++的稀释度的倒数为判定终点,为1个血凝单位。 凝集效价：能使血球产生++凝集的病毒最高稀释度为病毒的凝集效价，即0.5ml病毒液含1个血凝单位。 三、补体结合试验 补体：正常人和动物血清与组织液中的一组经活化后具有酶活性的蛋白质，辅助抗体介导免疫溶菌和溶血作用。对热不稳定。 绵羊红细胞与抗绵羊红细胞抗体（溶血素）作用形成溶血素致敏的绵羊红细胞。补体可使这种致敏红细胞溶解。 补体可结合任何病毒抗原抗体复合物 三、补体结合试验 如果反应系统中存在待测的抗体（或抗原），则抗原抗体发生反应后可结合补体；再加入指示系统时，而不出现溶血，是为补体结合试验阳性。 如果反应系统中不存在的待检的抗体（或抗原），则在液体中仍有游离的补体存在，当加入指示系统时会出现溶血，是为补体结合试验阴性。 三、补体结合试验 有3个系统： ①反应系统，即已知的抗原（或抗体）与待测的抗体（或抗原）； ②补体系统； ③指示系统，即SRBC与相应溶血素，形成致敏红细胞。 三、补体结合试验 病毒抗原 从组织培养、鸡胚和动物试验中获得病毒抗原 应适当提纯，纯度愈高，特异性愈强 如使用粗制抗原时，须经同样处理的正常组织作抗原对照，以识别待检血清中可能存在的、对正常组织成分的非特异性反应 三、补体结合试验 抗体 免疫用的病毒抗原最好不是同一细胞或动物，以免发生交叉反应 血清样品应加热灭活处理，消除补体活性和非特异性抗补体活性 人和豚鼠灭活温度为56℃；家兔和马灭活温度为65℃ 三、补体结合试验 补体 检测人和哺乳动物血清应用豚鼠新鲜血清补体 临用前使用 1％SRBC制备 绵羊颈静脉采血，生理盐水洗涤 溶血素 用绵羊红细胞免疫家兔获得 效价达到1:4000可获得 56℃30分钟灭活，加甘油后长期保存 稀释液 含钙镁离子的生理盐水，可维持补体的稳定 三、补体结合试验 溶血素的滴定 先将溶血素稀释成1:100~1:1000,再依次加入溶血素0.1ml，钙镁盐水0.2ml，1:60补体0.2ml、1％绵羊红细胞0.1ml，混匀后再水浴 结果判定：完全溶血的试管液体红色透明，离心后见少许细胞;不溶血的试管液体混浊，放置后见红细胞沉淀，上清无色透明 溶血素效价的测定;以完全溶血的最高稀释倍数确定为1个单位 本例1个单位的溶血素的效价为1：4000；正式使用2个单位 三、补体结合试验 补体的滴定 补体不稳定，每次试验前需滴定 管号 1：60补体 钙镁盐水（ml) 2U抗原(ml) 1％致敏SRBC(ml) 结果 1 0.04 0.26 0.1 0.2 不溶 2 0.06 0.24 0.1 0.2 不溶 3 0.08 0.22 0.1 0.2 微溶 4 0.10 0.20 0.1 0.2 微溶 5 0.12 0.18 0.1 0.2 全溶 6 0.14 0.16 0.1 0.2 全溶 7 0.14 0.14 0.1 0.2 全溶 三、补体结合试验 确实单位（exact unit） 将完全溶血的最小补体量，如上图1：60补体