针对Bt转基因米结构特异基因的实时荧光(Real-time)PCR检测方法的研究.docVIP

附件二： 参考译文： 针对Bt转基因大米结构特异基因的 实时荧光（Real－time）PCR检测方法的研究 Dietrich Made， Christine Degner， Lutz Grohmann 摘要： 中国的转基因大米品系已接近获得农业种植与生产的批准。但是，迄今还没有检测此转基因作物的方法进行报道。在本研究中，以田间测试为Bt大米（“Anti-pest Shanyou 63抗虫籼优63”和“Anti-pest Jinyou 63抗虫粳优63”）做为研究对象，对其转基因DNA序列进行研究。Real-time PCR检测方法针对的区域为苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白基因cryIA（b）及cryIA(c)融合基因和农杆菌的胭脂碱合成酶基因（nos）终止子之间的序列。此Bt大米特异检测体系吸纳了最近发表论文中Real-time检测大米（Oryza sativa L）内源基因gos9的内容。检测转基因Bt大米的整个方法进行了内部验证，确定检测限值为0.1％（Bt大米 / 大米整体）。应用PCR方法可更精确地检测欧盟尚未批准的转基因大米。 关键词： 转基因生物，大米（Oryza sativa L），Bt毒蛋白，内源基因，Real-time PCR, 检测方法 简介 在欧盟，转基因（GM）食品的批准与使用应遵照法令(EC) No 1829/2003和(EC) No 1830/2003的规定[1,2]。由于全球的转基因作物的种植不断增长，欧盟各成员国必须依据这些规定进行全国食品监督，以防止含有或来源于未经欧盟批准的转基因生物的食品与饲料进入欧盟市场。 亚洲的植物转基因产业是新的转基因作物品性的主要集中地，许多已接近获得批准和可能很快就投放市场[3]。在中国，水稻的种植面积超过20％，并通过大量使用除草剂和杀虫剂达到了较高的产量。能抵抗害虫或除草剂的转基因大米可以减少此类化学品的用量[3,4]。几个不同的转基因水稻品系已在公众的GMO资料库有所描述[5,6]。至少四个已经通过了田间试验、环境释放试验，目前正处在预生产阶段。一种含有Xa21基因可以抵抗白叶枯病的转基因水稻在2001年就进入了预生产阶段，但中国农业部没有最终批准，原因是需要更多的生物安全资料。另一种转基因水稻被转入了豇豆胰蛋白酶抑制（CpTI）基因以获得抗虫特性，在1999年被批准进行环境释放试验，之后被引入杂交水稻GM II-Youming 86，2001年开始进入预生产阶段。已经被研究并批准进行环境释放的表达Bt毒蛋白的转基因水稻至少优两个Bt水稻品系,“GM Shanyou 63”和“Kemingdao”在2001年进入预生产阶段。 去年，国际环保组织绿色和平（Greenpeace）对中国市场上的GM水稻品系进行了调查。从中国湖北省的当地种子公司、农业推广站和农场购买了一些大米样品。由一家商业的GMO检测实验室对所采集的样品进行了DNA与蛋白方面的检测。25个样品中的19个显示存在转基因大米。几个样品的DNA扫描检测为阳性，同时CryIA(c)蛋白检测也为阳性，提示这些大米品系表达Bt蛋白。 检测GMOs的分析方法和在食品或饲料中含量的方法主要是基于DNA的聚合酶链式反应（PCR）。由于Real-time PCR具有的高特异性、使用方便的特点，都能应用于GMO定性与定量检验。大多数Real-time PCR进行扩增时都是采用水解荧光探针（TaqMan）。为了满足GMO含量检测的需要，欧盟对于单倍体基因组拷贝也采用此类方法。为了建立转基因作物的检测方法，必须要得到阳性检验材料。但是对于在欧盟没有进行研究和种植的或者没有得到欧盟批准的转基因品系，是非常难于获得可信的阳性材料。 为了建立针对在中国已接近商业化种植而欧盟还未批准的转基因大米的检测方法，我们使用了绿色和平（Greenpeace）进行调查时的两个大米样品做为参考材料。在推测参考材料含有GM Shanyou 63大米的基础上，建立了Real-time PCR方法检测部分结构特异性基因。本研究所建立的Bt大米品系检测方法也可以应用于进口食品中该成分的定量检测。 材料和方法 样品材料与DNA的提取 两个转基因大米样品（FR0502519，FR0502520）是由绿色和平友情提供，此样品为2005年春季在中国湖北省松滋（Songzi）县王家桥（Wangjiaqiao）镇农业推广站的水稻种子包装中采集。样品标记为“Anti-pest Shanyou 63（抗虫籼优63）”和“Anti-pest Jinyou 63（抗虫粳优63）”。 使用改良的CTAB核酸提取方法从粉碎材料中提取DNA。200mg粉碎过的大米样品中加入1.5ml CTAB 提取缓冲液（20g/L CTAB,1.4mol/L NaCL,0.1mol/L Tri