腺病毒表达系统要点.pptVIP

病毒表达系统的特点 高转染效率 高蛋白表达水平 对转染效率很低的细胞进行高效转染 (原代细胞等) 稳定,可遗传的表达 (逆转录病毒) 可控制拷贝数 重组腺病毒的作用 在哺乳动物细胞中，AdV已被成功应用于表达各种病毒和细胞的基因，腺病毒表达载体系统表达出蛋白的生物化学特性，可用于商业价值的开发，它可用来生产亚单位疫苗，和新型诊断试剂盒的开发。 AdV可以通过转染细胞来表达蛋白，除基因治疗的相关实验外还可用做体内特性研究。 用AdV转染基因的优点 速度快，简单，不需要任何特殊的装备。 相对其它方法，它非常容易被接受。事实上，这种感染后细胞生存率几乎为100%。因此，AdV有向细胞内转染遗传物质而忽视毒性作用的能力。 许多细胞类型均可被转染。 感染后的数小时，基因表达便可被分析。 刺激后，可有一种以上的基因被同时表达。 重组腺病毒表达系统 通过对本体蛋白的同样的翻译后的修饰，在细胞中表达真核蛋白。 一系列腺病毒转换因素允许产生高水平的异种蛋白。重组蛋白代表了整个细胞蛋白的最丰富的多肽（20%-30%）。 在较好的条件下，表达系统在数升的293细胞悬浮培养液中可以按比例地增加，产量可达90mg/L。 构建重组腺病毒 构建重组腺病毒的传统方法是以同源重组为基础的。 其一用修饰的腺病毒DNA与穿梭载体在HEK 293细胞中进行同源重组； 通过Cre-loxP系统构建重组腺病毒载体，在转移质粒和包装质粒中都插入loxP位点，然后将两个质粒共转染表达Cre重组酶的哺乳动物细胞，通过Cre介导两个loxP位点之间的DNA发生重组，可获得重组腺病毒，这种重组效率比一般的细胞内同源效率高30倍。 更为流行的方法采用了穿梭载体与腺病毒质粒转化一种特殊的菌株(BJ 5183)。然后从细菌中收集重组腺病毒，用其感染HEK 293细胞。 为什么泛嗜性逆转录病毒的宿主范围如此广？ 外膜蛋白识别宿主细胞表面的受体 VSV-G外膜蛋白不需识别宿主细胞表面的受体 Package cell line GP2-293整合有gag-pol 基因 pVSV-G 载体与pLXRN 载体共转化 宿主的免疫反应仍然是获得转基因长期表达和重复使用腺病毒载体的主要障碍。大量研究已证实,具有感染性的腺病毒载体本身就足以引起免疫反应。 更为“复杂”的腺病毒载体就是第三代腺病毒载体,在其构建时去除了某些病毒基因,甚至是去除了全部的病毒基因。所谓的“空壳”载体起先只保留了ＩＴＲ和包装信号,且在产生中需要辅助病毒和合适的互补包装细胞,更需要进一步的纯化。 第三代腺病毒载体 第三代新型重组腺病毒载体删除病毒基因中所有开放阅读框,仅含有必要的顺式元件(即ITR和邻近的包装信号序列) ,需要在辅助病毒存在情况下,在包装细胞中繁殖,其安全性很高。 第三代腺病毒载体不但可容纳较大的外源基因(32kb) ,而且较容易获得高滴度( 109pfu /ml) 。 第三代新型重组腺病毒载体 腺病毒在寄主细胞中呈游离态，基因瞬时表达 可侵染处于分裂期或非分裂期的寄主细胞 高水平的蛋白质表达 双载体系统的操作 病毒的效价可达 1012 pfu/ml 平均可插入8kb的外源片段 长期、稳定的基因表达，可以遗传 只能侵染分裂期的寄主细胞 中度的蛋白表达水平 单一载体操作 病毒效价达 106 pfu/ml 平均可插入6.5kb的外源片段 腺病毒表达系统 逆转录病毒表达系统 Adeno-X? VS Retrovirus Expression System Retroviral Expression System 逆转录病毒表达系统 Env、pol、gag为RNA病毒中控制复制和表达外膜蛋白的基因。 重新构建的反转录病毒载体将去除gag、pol、env基因，并将它们整合到包装细胞株的基因组中。 ?+是RNA病毒包装时的识别序列，保留在反转录病毒载体中。 逆转录病毒载体的构建和改造 逆转录病毒的包装过程 Retro-X Retroviral Expression Vectors LRCX Retroviral Expression Vectors MSCV Retroviral Expression System 小鼠干细胞病毒表达载体 造血细胞 胚胎干细胞 胚胎性癌细胞 Pantropic Retroviral Expression System 宿主范围广 泛嗜性逆转录病毒表达系统 * * Gene of Insert 腺病毒表达系统 质粒型表达载体 病毒型表达载体 真核生物细胞常用的表达载体 腺病毒表达载体 逆转录病毒表达载体 昆虫杆状病毒表达载体 如何选择合适的病毒表达载体？ 可适用的宿主细胞类型 选择标