动物蛋白质的提取和含量测定技术方案.ppt

组员：LS、GLL、ZXJ、XA、LBN 蛋白质 ？？？ 小知识 1.蛋白质是由氨基酸以“脱水缩合”的方式组成的多肽链经过盘曲折叠形成的具有一定空间结构的物质。 2.蛋白质有一级、二级、三级、四级结构。 3.功能： 结构蛋白：作为细胞的结构，如膜蛋白，染色体蛋白等。 蛋白质是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。 知识加油站 1.蛋白质的提取、分离和鉴定工作是生物工程中一项十分艰巨的任务。要想分离提纯某一特定的蛋白，首先必须把蛋白质从组织活细胞中以溶解的状态释放出来。 2.动物组织或动物细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎，细菌和植物细胞可用超声波、高压挤或砂研磨等方法进行破碎。 3.大多数蛋白质均可溶于水，稀酸或稀碱溶液中，可采取不同溶剂提取，分离及提纯蛋白质。 动物蛋白的提取 提取： 一、物理方法： 1.取新鲜组织称重，用眼科手术刀将组织剪成小块放入试管中。 2.加入动物蛋白裂解缓冲液，并转移到匀浆器中 3.在冰浴条件下用匀浆器低速匀浆至组织完全裂解 4.裂解液于预冷的离心机中以12000rmp离心13分钟，上清液立即转移入新的离心管中保存。 温馨提示： 若短时间不用，可置于4℃保存。 较长时间不用，可置于-20 ℃或更低温度保存。 防止提取出的蛋白质变性失活 二、化学方法： 1.水溶液提取法 提取动物组织蛋白质一般采用各种水溶液。稀盐和缓冲体系的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大，是最常用的溶剂。稀盐溶液（一般用氯化钠溶液）可促进动物蛋白质溶解，同时因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的特点。 2.有机溶酶法 粉碎后的新鲜材料在0℃以下加入5～10倍量的丙酮，迅速搅拌均匀，可破碎细胞膜，破坏蛋白质与脂质的结合。蛋白质一般不变性，被脱脂和脱水成为干燥粉末。用少量乙醚洗，经滤纸干燥，如脱氢酶等可保存数月不失去活性。  3.有机溶剂提取法 一些蛋白质和酶与脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多，不溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂提取。它们具有一定的亲水性和较强的亲脂性，是理想的提取脂蛋白质的溶剂，但必须低温操作。 动物蛋白的含量测定 1.荧光光度法： 荧光是发射光,是分子、原子吸收光辐射被激发,接着再发射出与吸收波长相同或波长更长的光,是光致发光现象。 利用荧光技术测定蛋白质的方法有两类,一是测定蛋白质的自身荧光,利用外加物质使蛋白质自身荧光猝灭;二是利用荧光指示剂即荧光探针进行测定。 温馨提示： 荧光法具有灵敏度高、选择性好的特点,且简单快速、取样量少,在生理科学上广泛应用。20世纪80年代以来荧光光度法已广泛进入生物、化学、医药、环保等方面。 2.考马斯亮蓝G-250染色法： 实验原理： 利用蛋白质与颜料结合的原理，定量测定微量蛋白质浓度。 考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过范德华键结合后，变为蓝色，且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，可在595nm处比色测定。2—5分钟即呈最大光吸收，至少稳定1小时。 温馨提示 此法操作简便迅速，消耗样品量少，但不同蛋白质之间差异大，且标准曲线线性差。高浓度的尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂时测定有干扰。缓冲液浓度过高时，改变测定液pH值会影响显色。 其它方法： 双缩脲法、 紫外吸收法、 等离子共振法、 微量凯氏定氮法、 Folin试剂法（Lowry法） * 功能蛋白：1.物质运输：如载体蛋白，血红蛋白2.催化功能：如绝大多数酶3.信息交流：如受体（糖蛋白），蛋白质类激素4.免疫：如抗体，淋巴因子等免疫分子 提取： 提取： 提取： 提取： 测定： 常使蛋白质与荧光探针作用,多是一些荧光染料,有时也用其他试剂,与蛋白质结合后,光谱呈现出能量转移特征,引起荧光增强或减弱,即敏化荧光和荧光猝灭现象,由增强或减弱的程度来测定蛋白质的含量。 测定： 测定： 测定： 测定： 测定： *