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常用分子生物学技术的 原理及应用 The popular technology in molecular biology: principle and application 主 要 内 容 一、分子杂交与印迹技术 二、PCR技术的原理与应用 三、核酸序列分析 四、基因文库 五、生物大分子相互作用研究技术 六、遗传修饰动物模型的建立和应用 第 一 节分子杂交与印迹技术Molecular hybridization  blotting technology 斑点印迹 (dot blotting) 第 二 节 PCR技术的原理与应用 　 　 PCR反应条件　 　　 　　　　　　 PCR的反应体系　 模板DNA 引物 Taq DNA聚合酶 4种dNTP 含Mg2+的缓冲液。 其他PCR技术 （三）原位PCR技术 (in situ PCR) 原位PCR技术就是将PCR技术的高效扩增与原位杂交的细胞定位结合起来，从而在组织细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特定的DNA或RNA序列。 保持了两项技术的优势又弥补了各自的不足。是细胞学诊断中一种崭新的检测技术。 （四）实时PCR技术 (real time PCR) 实时PCR(real-time PCR)技术通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量PCR。 两种方法：SYBR green（荧光染料掺入法）和Taqman probe （探针法）。 第 三 节核 酸 序 列 分 析Nucleic acid sequence analysis 双脱氧末端终止法 下一代测序技术 又称为二代测序技术，其代表技术为罗氏公司(Roche)的454测序仪(Roche GS FLX sequencer), Illumina公司的Solexa基因组分析仪(Illumina Genome Analyzer)和ABI的SOLiD测序仪(ABI SOLiD sequencer)。 基 因 文 库Gene Library （二）免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation） 是以抗体和抗原间专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 原理：如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。 实验流程示意图 缺点为： 1. 可能检测不到低亲和力和瞬间的Pr-Pr相互作用 2. 两种Pr的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用； 3. 必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。 原理：在活细胞状态下用化学交联试剂固定蛋白质-DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合物，再利用PCR技术特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。 即动物整体克隆技术，将动物的一个体细胞核全部导入另一个体的去胞核的激活的卵细胞内，使之发育成个体，即克隆(clone)。 　 电泳迁移率变动测定（EMSA）和染色质免疫沉淀（ChIP）只能确定DNA序列中含有核蛋白结合位点，故尚需结合DNA足迹实验和DNA测序等技术来确定具体结合序列。 遗传修饰动物模型的 建立及应用 The Establishment and Application of Heredity-Modified Animal Model 第六节 ddCTP ddATP ddTTP ddGTP dCTP dATP dTTP dGTP 5′ T G A A T G A 3′ A C G C T ABI 3730 DNA测序仪 DNA自动测序结果举例 表示一个SNP位点，该位点出现了双峰，对应的核苷酸分别为C和T，因此该位点为CT杂合型，如果该位点只有一个峰C或者T，则该位点基因型为CC或TT纯合型 目前所用测序技术的缺点 1、原理基于DNA链终止法，故测序长度受限，目前为1000 nt左右。 2、测序反应费时费力 科学家们完成第一个人类基因组测序整整花了13年的时间，耗费了30亿美元的费用。 3、测序准确度不高 DNA聚合酶造成的碱基错配，DNA序列判读错误。 4、测序基于PCR反应，需要引物，并且有些结构复杂的难于进行PCR反应的片段不能测序。 ① 可实现大规模并行化分析 ② 不需电泳，设备易于微型化 ③ 样本和试剂的消耗量降低，降低了测序成本 优势： 测序策略主要基于循环芯片测序法（Cyclic-array