第十章高效液相色谱法分析.pptVIP

* 第十章 高效液相色谱法 (High Performance Liquid Chromatography，HPLC) §10－1 概述 一、高效液相色谱法概述 高效液相色谱法（HPLC）吸取了气相色谱与经典液相色谱优点，并用现代化手段加以改进。它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点，因此得到迅猛的发展。目前已成为应用极为广泛的化学分离分析重要手段。 二．进样系统 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～30cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。 进样装置： 注射器进样； 高压定量进样阀； 三、分离系统——色谱柱 色谱柱包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜，内衬光滑的聚合材料。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm，凝胶色谱柱内径3～12mm，制备柱内径较大，可达25mm 以上。一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离柱的性能不受影响。 1．高效液相色谱法与经典液相色谱法的比较 高速：在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达 103cm·min-1. 例如分离氨基酸，用经典色谱法，柱长约170cm，柱径0.9cm，流动相速度为30cm3·h-1，需用20多小时才能分离出20种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需lh之内即可完成； 高效：其柱效可达3万塔板/米以上（气相色谱约2000 塔板/米），分离效率大大提高了。 四．检测系统 在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。一类是溶质型检测器，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。 p163 （l）紫外检测器 （2）荧光检测器 （3）示差折光率检测器 （4）电导检测器 2．高效液相色谱法与气相色谱法的比较 （l）气相色谱法分析对象只限于气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20％。对于占有机物总数近80％的那些高沸点、热稳定性差、离子型化合物及摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析； (2)气相色谱采用流动相是惰性气体，它与组分不产生相互作用力，仅起运载作用。而高效液相色谱法中流动相对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争，流动相对分离起很大作用，因此，可选用不同极性的液体，选择余地大，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便； （3）气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作； 高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操作严格，这是它的主要缺点。 二、 影响液相色谱分离的因素 气相色谱所讨论的基本概念及基本理论，如：保留 值，分配系数，分配比，分离度，塔板理论，速率理 论等与液相色谱一致，但液相色谱流动相为液体，其 扩散系数，粘度，密度等与气体均有很大的差别，都 将对色谱分析过程产生影响。 三、提高液相色谱分离效率的措施 1、采用小而均匀的填料（担体），减小dp,? 2、减小填料孔穴深度，且孔径大； 3、用低粘度溶剂作流动相； 4、适当降低流动相流速； 5、适当提高柱温； 6、减小柱前柱后死体积。 §10－2 高效液相色谱仪 高效液相色谱仪一般可分为4个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统,另有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。其工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。 一．高压输液系统 由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是核心部件。对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出流量