分子生物学实验实验报告解析：.docVIP

分子生物学实验 目录 1．P38质粒提取及蓝白斑筛选和Southern杂交实验 4 1.1实验目的和原理： 4 1.1.1学习碱裂解法提取质粒的原理 4 1.1.2 掌握蓝白斑筛选的实验方法及原理 4 1.1.3地高辛标记的Southern杂交 4 1.2实验材料及实验仪器： 5 1.2.1 质粒提取 5 1.2.2蓝白斑筛选 5 1.2.3地高辛标记的Southern杂交 5 1.3 实验步骤 6 1.3.1 质粒提取 6 1.3.2蓝白斑筛选 7 1.3.3地高辛标记的Southern杂交 8 1.4实验结果及分析： 10 1.4.1 质粒PCR结果 10 1.4.2 质粒酶切结果 10 1.4.3蓝白斑筛选实验结果 11 蓝白斑筛选后菌落PCR结果 11 1.4.4 Southern杂交实验结果分析 12 2. GFP质粒提取转化及绿色荧光观察实验 13 2.1实验目的和原理 13 2.1.1 GFP质粒提取及转化同实验一中P38 质粒的提取及转化 13 2.1.2阿拉伯糖诱导绿色荧光蛋白的表达 13 2.2 实验材料及实验仪器（阿拉伯糖诱导绿色荧光蛋白的表达） 13 2.3 实验步骤 14 2.3.1Arabinose诱导GFP表达 14 2.4实验结果及分析： 14 3．植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 15 3.1 实验目的及实验原理 15 3.2 实验材料及实验仪器（植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析） 15 3.3 实验步骤 16 3.3.1基因组DNA提取 16 3.3.2酶切及电泳分析 16 3.4实验结果及分析 17 3.4.1小麦基因组提取电泳检测 17 4. RT-PCR并与基因组DNA PCR对比实验 18 4.1 实验目的和原理 18 4.1.1 RNA的提取 18 4.1.2 RT-PCR扩增目的基因DNA 18 4.2 实验材料及试验仪器 19 4.2.1 RNA的提取 19 4.2.2 RT-PCR扩增目的基因DNA 19 4.3 实验步骤 20 4.3.1 小麦RNA的提取 20 4.3.2 RT-PCR扩增目的基因DNA 20 4.4实验结果及分析 21 4.4.1提取RNA电泳检测结果 21 4.4.2 RT-PCR电泳检测结果 21 4.4.3 RT-PCR并与基因组DNA PCR对比 22 总体实验总结 22 1．P38质粒提取及蓝白斑筛选和Southern杂交实验 1.1实验目的和原理： 1.1.1学习碱裂解法提取质粒的原理质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，具有双链闭环结构的DNA分子。它具有自主复制能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。目前，经人工改造的质粒已广泛用作基因工程中目的基因的运载工具——载体。 质粒DNA的提取是依据质粒DNA分子较染色体DNA分子小，且具有超螺旋共价闭合环状的特点，从而将质粒DNA与大肠杆菌染色体DNA分离。现在常用的方法有：碱裂解法、密度梯度离心法、煮沸裂解法等。实验室普遍采用的碱裂解法具有操作简便、快速、得率高的优点。其主要原理：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=4.8的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 地高辛标记的Southern杂交地高辛随机引物法标记的原理：在随机引物法标记的反应液中，有随机合成的六聚核苷酸作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成插入地高辛的DNA链。以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应进行检测。一般通过酶标记地高辛抗体检测，就可以肯定杂交反应的存在。免疫检验一般用碱性磷酸酶系统，BClP/NBT显色，敏感性很高。 1.2实验材料及实验仪器： 1.2.1 质粒提取 （一）实验材料 含质粒的大肠杆菌DH5α （二）试剂 1. LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，溶解于1000mL蒸馏水中，用NaOH调pH至7.0。高压灭菌20分钟。 2. LB平板培养基：在每1000mL LB液体培养基中中加入15g琼脂，高压灭菌20分钟。 （三）仪器 1. Eppendorf管、离心管架 2. 10，100，1000 μl微量加样器 3. 台式高速离心机 4. 摇床、高压灭菌锅 （一）实验材料 （二）