兽医免疫学进展精要.doc

研究生课程论文（作业）封面 （ 2013 至 2014 学年度 第 1 学期） 课 程 名 称: 兽医免疫学进展 课 程 编 号: 6.517 学 生 姓 名： 孙刘妹 学 号: 130610503 年 级： 13级 任 课 教 师: 马波 提 交 日 期：2013年11月 7日 成 绩：__________________ 教 师 签 字：__________________ 开课---结课：第 2 周---第 15 周 评 阅 日 期： 年 月 日 东北农业大学研究生部制噬菌体展示肽库诊断抗原的设计及应用 孙刘妹1 （1东北农业大学动物医学学院） 摘　要： 噬菌体展示技术是一项新兴的分子生物学技术；该技术以噬菌体或噬粒为载体，使外源肽或蛋白基因与噬菌体表面特定蛋白基因在载体表面进行融合表达，进而通过亲和富集法筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体。噬菌体展示文库所展示的外源蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，并且能够将基因型和表现型有效地联系起来，是后基因组时代的有力工具。随着此项技术的不断完善和发展,噬菌体展示技术在众多领域得到了良好的应用。 关键词: 噬菌体展示技术； 原理； 诊断抗原 噬菌体展示技术（Phage display）是研究蛋白质分子与配体相互作用的常用技术。1985年，Smith首次通过基因工程手段，将外源基因插入丝状噬菌体基因组中，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使表达的外源肽或蛋白与噬菌体外壳蛋白一起展示在噬菌体表面，而不影响噬菌体的侵染和扩增，建立了噬菌体展示技术。其主要特点是将特定分子的基因型和表型统一在同一噬菌体颗粒内，被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构及生物活性，以利于靶分子的识别和结合[1]。近年来，噬菌体展示技术的应用，无论从研究的广度还是深度上，均取得了突破性的进展。本文仅就噬菌体展示技术及其在诊断抗原的应用作一综述。 1 噬菌体肽库展示的原理 噬菌体展示技术是一种噬菌体表面表达筛选技术，其原理是以噬菌体为载体，将外源核酸片段(一组随机多肽编码序列或基因群)克隆至噬菌体外壳蛋白基因中形成融合，并以融合蛋白的形式表达于噬菌体表面，众多融合型噬菌体便组成了噬菌体展示库(见图1)。随后，将噬菌体过柱，用固定化的靶分子去筛选与之亲和的噬菌体。通过与特定的靶标反应，不能结合的噬菌体被洗脱掉，而能结合的噬菌体被保留下来并通过感染大肠杆菌得以扩增和富集，实现高通量筛选。噬菌体展示技术的显著特点是建立了基因型和表现型之间的对应关系。操作简单易行，该技术采用经典的PCR分子克隆等技术即可操作，在几周内即可筛选106～108克隆，筛选获得抗体库可以用于原核系统表达，无需组织培养，极大地降低了成本。筛选获得噬菌体随机肽库具有容量大、体积小、筛选简便、制备成本低、可多次扩增等突出优点［2］。 图1 噬菌体展示技术的原理及过程示意图[19] 2 噬菌体肽库展示系统分类 2.1 丝状噬菌体展示系统 Ff丝状噬菌体包括M13、fd和f1亚类，三者的核酸序列同源性在80%以上。这些噬菌体基因组是单股环状DNA，核酸外包裹着外壳蛋白，包括主要衣壳蛋白pⅢ和两端的4种次要衣壳蛋白pⅥ、pⅦ、pⅧ、pⅨ。5个衣壳蛋白均可用于展示外源多肽或蛋白，但目前最常用的是基因Ⅲ编码的pⅢ蛋白和基因Ⅷ编码的pⅧ蛋白。pⅢ蛋白位于噬菌体颗粒尾部，通过C-端附近的穿膜区锚定在膜上，可插入的外源蛋白位于pⅢ的早期成熟区，直接或间接与信号肽切割位点相连。pⅢ蛋白展示系统最突出的特点是对外源多肽或蛋白的大小无严格限制，可展示相对分子质量高达50000的蛋白。野生型的噬菌体含有约3～5个拷贝的pⅢ蛋白［3］，其拷贝数低，适合筛选高亲和力的配体。pⅧ是M13噬菌体主要衣壳蛋白，为含2700～3000个拷贝的50个氨基酸残基的α螺旋。外源蛋白一般插入N-端或近N-端，由于pⅧ分子较小，只能融合较小的外源肽段（如5肽或6肽），携带肽段太大会影响噬菌体外壳的组装，使其失去感染力。pⅧ蛋白拷贝数高，适合筛选低亲和力的配基。丝状噬菌体感染E.coli细胞是通过F菌毛介导, 噬菌体外壳pⅢ蛋白N-端参与噬菌体穿过细胞膜以及与F菌毛的结合，两者在感染过程中缺一不可。丝状噬菌体在细菌细胞质内装配，从感染的细菌体内释放时并不裂解宿主菌。 2.2 其他噬菌体展示系统 除丝状噬菌体展示系统外，新近开发的噬菌体展示系统还有λ 噬菌体、T4噬菌体和T7 噬菌