第一章酶分析法(二)精要.doc

酶分析法概述 一.定义: 酶分析法是利用酶的催化反应进行待测物测定的一类分析方法. 二.基本原理: 通过测定反应中底物的减少量或产物的增加量直接或间接完成酶活性（含量）测定 底物,辅酶 激活剂抑制剂含量测定 三.分析对象-----两类 酶活性测定 底物测定：底物辅酶激活剂抑制剂（酶做为工具 工具酶） 四.特点 ①高选择性 以酶为分子识别试剂 最吸引人的地方 复杂基体不经复杂分离，直接测定 生化分析特点 ②高灵敏度 高催化活性 催化放大作用 五.分类 基于酶状态 1.基于可溶性酶的酶分析法 ①②类 2.基于固定化酶的酶分析法 ②类 3.基于酶传感器的酶分析法 ②类 基于分析对象 ①酶---酶活性测定，包括抑制剂 激活剂（酶是待测物） ②底物.辅酶.抑制剂.激活剂 （酶是分析试剂）  基于可溶性酶的酶分析法（酶活性浓度测定） 酶活性浓度测定原理 1.酶促反应历程 图： 酶量固定. 底物量固定，进行反应 产物浓度——时间 曲线 反应速度——时间 曲线 动态期 平衡期 延滞期 线性反应期 非线性反应期 零级反应 反应速度恒定且最高 2.酶的活性测定 酶活性定义: 最适条件下.单位时间（min）催化1μmol底物酶量IU 温度 有多少IU酶 pH 看1min能催化多少μmol底物 底物浓度[s]  ( 酶活性=反应速度V =最大反应速度Vmax =反应初速度(理论上) =线性反应期反应速度(实际) ( 关键要求 [s]≥10Km 底物浓度大大过量 目的——达到Vmax 3.测定反应速度的方法 固定时间法（fixed time assays） 一般采用两点法: [P]0 [P] 图 t0 反应开始10%---20% t 反应开始 强制终止反应 具体方法： 加酸、加碱、沉淀剂 特点: （1）简单 许多实用方法来源于此 必须在线性反应期,否则误差较大 (3)看不到曲线全貌 ②连续监测法（Continuous assay） 连续监测整个反应过程—酶反应时间曲线图—求反应速度 隔（10-60s）测一次 在线监测,多点监测 定量酶活性 特点: 较准确,目前使用较多 3.标准曲线法（另一类方法） 不同浓度标准酶—在一定时间—反应速度—酶活性测定 E0 E1 E2 E3 E4 E5 Ex图 [P]0 [P]1 [P]2 [P]3 [P]4 [P]5 [P]x 特点：使用不多,需标准酶—已知活性的酶，种类少,价格高 方法比较: 标准曲线:需酶标准品 相对分析法，用得不多 固定时间和连续监测法:不需酶标准品 绝对分析法, 直接测活性 二.酶活性测定方法 （介绍具体方法, 以上是原理性的） 主要介绍连续监测法——应用较多 固定时间法是连续监测一种简化,分析方法上要求低 连续监测法的分析体系,固定时间法亦可使用 1.直接连续监测法 ①原理 酶 反应物 + 底物 ———— 产物1 + 产物2 反应物或底物的减少 产物的增加 检测 检测 检测 检测 光度,荧光，pH，电化学，气量法,量气法（gasometric） 实例: 乳酸脱氢酶 （1）L-乳酸 + NAD+ —————— 丙酮酸 + NADH + H+ 没有吸收于 340nm (max=340 nm