11-金黄色葡萄球菌PFGE方案.docVIP

金黄色葡萄球菌脉冲场凝胶电泳标准操作程序 编号 PN-SOP-11 执行日期 2010年 12月 15日 第一天 1.菌悬液的制备 1）在Falcon 2054管上标记样品名称和空白对照，分别加入约1-2mlCSB缓冲液。 2）在1.5ml eppendorf管上标记好对应样品的名称。 3）用棉棒从培养皿上刮取适量细菌，悬浊于CSB中，用eppendorf分光光度计测其OD值，调整至5.5～6.5之间。注：如果样品数量多，调完OD后先存放于4℃。 4）取250μl菌悬液于相应的1.5ml eppendorf管中。 5）加入2μl溶葡萄球菌酶（1mg/ml），用移液枪充分吹打。不需振荡摇匀。 2.胶块的制备 1）准备10ml的1% SKG（称取0.1g SKG溶于TE，用微波炉加热至完全溶解，放在53℃～56℃水浴中）。 2）取250μl预热（53℃～56℃）的SKG，与250μl菌悬液混合，用移液枪轻轻吹打5次左右至液体混匀，避免产生气泡。混合前菌悬液可在水浴里预热10秒，并摇匀。 3）将混合物立即加入模具，避免产生气泡，在室温下凝固10～15分钟或置于4℃冰箱5分钟。 3.细胞的裂解 1）在50ml的screw-cap tube上做好标记。 2）配制细胞裂解液（CLB），参见表1。蛋白酶K原液须放在冰上或冰盒里。 表 1 样本数量 CLB 蛋白酶K（20mg/ml） 1 4ml 30μl 10 40 ml 300μl 3）每个管子加入4ml蛋白酶K/CLB混合液。保证胶块在液面下而不在管壁上。 4）将管子放在54℃水浴摇床中孵育2小时，转速约170转/分钟。 5）将纯水和TE放在54℃水浴中预热。 4.洗胶块 1）从水浴摇床中拿出screw-cap管，盖上绿色的screened-cap，轻轻倒掉CLB。 2）每管中加入15ml预热的纯水。确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上，放回54℃水浴摇床中，摇15分钟。 3）倒掉水，加入15ml预热的TE，在54℃的水浴摇床中重复洗3次，时间分别为15分钟，15分钟，30分钟。 4）倒掉TE，加入5ml TE，放在4℃冰箱保存备用。 第二天 5.胶块内DNA的酶切 1）准备30℃和37℃水浴。在1.5ml eppendorf管上标记好相应样品的名称。 2）按照表2，配制SmaI的稀释缓冲液，混匀。注意：须带手套操作，缓冲液和BSA置于冰上。 表2 试剂（Takara） μl/胶块 μl /7胶块 μl /12胶块 纯水 160μl 1120μl 1920μl 10×T Buffer 20μl 140μl 240μl BSA（0.1％） 20 140 240 总体积 200μl 1400μl 2400μl 3）按照表3，配置XbaI的稀释缓冲液。注意：须带手套操作，缓冲液和BSA置于冰上。 表3 试剂（Promega） μl/胶块 μl /3胶块 纯水 178μl 534μl Buffer D 20μl 60μl BSA（10mg/ml） 2 6 总体积 200μl 600μl 4）在每个1.5ml eppendorf管中加入200μl稀释缓冲液。 5）用刀片切下2mm宽的胶块放入1.5ml eppendorf管中。确保胶块在液面下面。将剩余的胶块放回原来的TE中。 6）用同样的方法处理标准株H9812的胶块，放入XbaI缓冲液中。 7）将XbaI管子放在37℃水浴中，SmaI管子放在30℃水浴中孵育10-15分钟。 8）在用稀释缓冲液孵育的过程中，按照以下的比例配制酶切缓冲液，混匀。表4 试剂（Takara） μl/胶块 μl /7胶块 μl /12胶块 纯水 155μl 1085μl 1860μl 10×T Buffer 20μl 140μl 240μl BSA（0.1％） 20 140 240 SmaI 5 35 60 总体积 200μl 1400μl 2400μl 表5 试剂（Promega） μl/胶块 μl /3胶块 纯水 173μl 519μl Buffer D 20μl 60μl BSA（10mg/ml） 2 6 XbaI 5 15 总体积 200μl 600μl 9）孵育完，用移液枪吸出液体，吸液时枪头应贴到管底，注意避免破坏胶块。 10）每管加入200μl内切酶混合液，确保胶块在液面的下面。 11）将XbaI管子放在37℃，SmaI管子放在30℃水浴中孵育3～4小时。 6.制备1％胶 1）称取1g SKG，溶于100ml 0.5×TBE缓冲液中。15孔模具需配制150ml体积的胶。 2）微波炉加热约2分钟，每20妙混匀，直至完全溶解。 3）放在53℃～56℃水浴，5～6分钟。 7.加样 1）调整梳子的高度