细菌学检验技术教案分析.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * Rough and smooth colonies of P. * * * 0.1SSC G+C mol%=2.44Tm-69.3 * * S * * * * * * 脉冲场凝胶电泳分型和流行病学分析 病毒分离与鉴定 病毒的分离 要分离到病毒，首先要采集到含有足够量活病毒的标本，并且要找到敏感的组织或动物。? ㈠标本的采集和运送specimen collection,transport 为了保证采集足够量活病毒标本，必须注意三个问题： 1.采集何种标本 一般是根据临床症状、流行病学进行分析、初步推断可能是哪一种病，再决定采集何种标本。 用拭子采集到的标本，应立即浸泡于肉汤中，有的病毒不稳定，如单纯疱疹病毒、流感病毒等，应尽可能早地接种到敏感动物和组织中。 血液标本有的须加抗凝剂，有的不加，如乙脑病毒主要存在于血清中，全血或血清接种均可；有的病毒主要吸附在白细胞上或红细胞上，因此采血时加抗凝剂可提高分离率。应避免用柠檬酸钠之类的抗凝剂，因动物接种不易耐受。一般是1/1000 的肝素少许或把血液放入含有消毒玻璃球的瓶内震荡脱纤维。 2.采集标本时间 一般在发病的早期(acute phase),越早越好，晚期体内易产生抗体，病毒成熟释放减少, 分离病毒比较困难。同时晚期可能发生交叉感染，增加判断困难。尸体标本最好在死后6小时内采集，否则病毒容易死亡。 3.标本的运送 由于大多数病毒对热不稳定，以立即接种为好，如需运送或保存,必须在冷的环境,48小时内能送至实验室，一般在50%中性甘油中，4℃保存最好, 由于冻化过程能使病毒破坏，如需要保存较长时间才能进行检查，最好放在-20℃以下,干冰或液氮保存。 ㈡标本的处理 标本的处理主要有两方面：除菌和将组织标本中的病毒游离出来。 ? 1.除菌处理 采集标本应尽可能无菌操作，但有些标本，如大便、鼻拭子等，本身常带杂有大量的细菌必须除菌。 抗生素处理。抗生素的浓度及作用时间视标本而定，4℃过夜。 可以10000r/min离心20分钟，大部分细菌和杂质可以去除 对乙醚有抵抗的病毒如肠病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、痘病毒等可以加等量乙醚4℃过夜除菌。 2.研磨和稀释 用脑、脊髓等组织作为分离病毒的标本时，为了游离细胞内病毒，应该在研磨器充分研磨。稀释液常用pH7.2-7.6的肉汤、10%脱脂奶生理盐水、0.5%水解乳蛋白Hanks液，将组织制成10%悬液，中性甘油保存的标本，如果需要作脑内注射，应以生理盐水洗2-3次在研磨，磨好的标本2000r/min离心20分钟，用上清液接种动物和细胞。如果怀疑有细菌污染，应该在除菌处理。 标本的接种 标本接种于哪一种动物、鸡胚或细胞，以及选择哪一种途径，主要决定于病毒的嗜性。一般嗜神经性病毒主要动物脑内接种；嗜呼吸道病毒接种动物鼻腔及鸡胚尿囊腔；嗜皮肤性病毒接种动物皮内、皮下或鸡胚绒毛尿囊膜；嗜内脏病毒可接种动物的腹腔、静脉、肌肉等。近年来，由于组织培养技术的广泛应用，多数病毒都能够用组织培养进行分离鉴定。 1.动物接种 主要观察有无发病症状。 用动物分离病毒，要注意动物本身的病毒被分到的可能，即应该排除动物自发性病毒的可能。所以对实验动物的健康状况应该有所了解。尽量选用级别较高的实验动物。 2.鸡胚接种 鸡胚羊膜腔和尿囊腔分离病毒，一般是测定其血凝素的产生，如流感病毒、新城疫病毒；绒毛尿囊膜接种主要观察其痘斑。卵黄囊接种主要观察鸡胚的死亡。 3.组织培养上的表现 病毒感染可以引起特殊的细胞病变可以归纳为5种类型 肠道病毒 细胞圆缩、小、分散、不聚集、全部细胞受破坏 腺病毒 细胞肿大、颗粒增多、病变细胞聚集成葡萄状 虫媒病毒 细胞圆缩、聚集、脱离、不完全破坏整个细胞，有的病毒能在细胞内繁殖而无明显的病变 SV40 胞浆中有空泡形成 痘病毒、疱疹病毒、合胞体病毒 有多核巨细胞形成 3.组织培养上的表现 病毒感染可以引起特殊的细胞病变可以归纳为5种类型 肠道病毒 细胞圆缩、小、分散、不聚集、全部细胞受破坏 腺病毒 细胞肿大、颗粒增多、病变细胞聚集成葡萄状 虫媒病毒 细胞圆缩、聚集、脱离、不完全破坏整个细胞，有的病毒能在细胞内繁殖而无明显的病变 SV40 胞浆中有空泡形成 痘病毒、疱疹病毒、合胞体病毒 有多核巨细胞形成 血凝特性 许多病毒能吸附一定的哺乳动物和鸟类红细胞的表面产生雪凝现象。有的病毒发生血凝要求一定的pH值和温度，有的病毒还可以作血凝抑制试验进行血清学鉴定。 血细胞吸附现象 有些病毒在组织培养细胞内可以繁殖，但不引起病变，也不