疏水色谱201306051教案分析.pptVIP

疏水色谱的进展研究 添加文本 随着生命科学的发展,用生物技术生产的产品需要进行分离和分析。作为分离、纯化和制备生物大分子有效手段的高效液相色谱法(HPLC)在生物工程的下游技术中占有重要的地位。但是,众所周知,在生化分离过程中,普遍存在蛋白质易失活问题,特别是用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)纯化时,由于流动相中大量有机溶剂的存在,使蛋白质的生物活性难以保持。高效疏水色谱法(HPHIC)则克服了这一缺点。由于它是用含盐水溶液作为流动相,固定相的疏水性适中,具有分离条件温和、不损伤蛋白质活性、分离效率高以及柱容量大等优点,因此在生化分离中,特别在活性蛋白质的分离中,日益成为人们优先考虑的色谱分离手段。 前言 目录 疏水色谱法的理论 疏水色谱法的固定相 疏水色谱法的应用 添加文本 疏水色谱填料是由化学性质稳定,机械强度好的载体(如琼脂糖、硅胶等)和疏水配基(如C6、C8等)组成。一般来说,蛋白质表面存在着一些疏水区域,借助于疏水区域和疏水配基间的疏水相互作用力,蛋白质被吸附在色谱填料的表面,并且高盐浓度可以加强这一作用力。因此,可以利用不同蛋白质间的疏水性差异,通过改变洗脱时的盐浓度就可以对蛋白质进行有效地分离纯化。 一、疏水色谱法的理论研究 二、疏水色谱法的固定相 非多孔填料 有机填料 无机填料 大孔膜 添加文本 疏水色谱法固定相的发展与其它色谱法一样,HPHIC发展的技术核心仍然是研制和开发新型的色谱填料。 添加文本 在无机填料中,由于硅胶的机械性能好,孔结构和表面积易于人为控制,并有较好的化学稳定性,因此应用最广泛。但硅胶的pH值应用范围较窄(2. 0～8. 0),且残留在硅胶表面上的硅羟基会对蛋白质产生不可逆吸附。另外,硅羟基的解离也会使填料具有阳离子交换性质,从而使分离产生混合机理。为了克服这些缺点,近年来多用高分子涂层硅胶填料代替单纯的硅胶填料。这种填料通常选用合适的聚合物、寡聚物或单体,使其在硅胶表面上形成致密的聚合物涂层,它既具有高聚物的化学稳定性,又具有硅胶基质的高机械强度。 1.无机填料 Schomburg和Petro已先后对聚合物涂层技术的发展作了评述。目前出现的HPHIC的涂层硅胶种类很多,如用乙烯基甲基二乙氧基硅烷与乙烯基吡咯在硅胶表面上聚合得到的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)涂层硅胶填料,对蛋白质和多肽具有良好的选择性。N-丁基聚丙烯酰胺涂层硅胶填料 以及通过戊二醛作交联剂制成的壳聚糖涂层硅胶填料,在分离生物大分子中各具特色。由于这些填料的硅胶表面上的硅羟基被高分子聚合物涂层掩盖,从而消除了分离过程中溶质的不可逆吸附及硅羟基的解离现象,并扩大了流动相使用的pH值范围。另外,高分子功能基多种多样,可制成多种疏水性不同的HPHIC填料。另一种无机基质是可控孔玻球,在其表面键合不同分子量的聚乙二醇制成醚型疏水固定相,对6种标准蛋白质有良好的分离效果。在大孔玻球上涂上N-丁基聚丙烯酰胺制成的疏水色谱填料对细菌外源凝集素也有较好的分离效果。 添加文本 以硬质高聚物微球为基质的填料是HPHIC固定相中另一研究热点。这种基质具有良好的化学稳定性, pH值应用范围宽,不容易产生不可逆吸附作用,特别是它与生物大分子有良好的生物相容性, 分离过程中能保持样品的生物活性,另外,在聚合物的表面容易进行化学改性,可形成多种固定相。对高聚物微球的合成主要采用“二步溶胀法”,最近Ogino等作了一些改进,使其成为一步溶胀法。利用二步溶胀法相继合成出的填料有交联聚苯乙烯、甲基丙烯酸缩水甘油脂-二甲基丙烯酸乙二醇脂共聚物、乙烯苯酚-二乙烯共聚物以及甲基丙烯酸甘油脂-二甲基丙烯酸甘油酯等。这些填料表面经过一定的亲水改性,都有可能制成HPHIC填料,只是难易程度有所不同。用戊二醛对聚氨基葡糖表面进行化学改性制成的HPHIC固定相对6种蛋白质分离,效果良好。 2.有机填料 K leinmann等用2-羟乙基异丁烯与乙烯基二异丁烯共聚物直接制成疏水色谱填料,其分离效果不太满意,但用苯甲酰氯和1, 2-环氧-3-苯氧基丙烷对该填料进行修饰后,其分离效果大大改善。Sing等采用聚氧乙烯型非离子表面活性剂包覆RP-HPLC填料的方法,使其转变为HPHIC填料,也取得较好的效果。关于有机基质的HPHIC填料,Rassi和卫引茂等最近分别作了评述。一种用“孔径比”衍生法制成的新型填料——缩水甘油甲基丙烯酸脂-乙烯-二甲基丙烯酸酯共聚物〔poly (glycidyl methacrylate-co-ethylene )dime-thacrylate〕单分散颗粒,使一根色谱柱具有HPHIC和RP-HPLC两种性能。这种填料中大孔径表面的苯基密度小,并分散有亲水官能团,而小孔径表面的苯基密度高,因此用这种填料装填的色谱柱既可在HPHIC体系中分离蛋白质,又可在R