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第三章 细胞生物学研究方法 第三章 细胞生物学研究方法 细胞形态结构的观察方法 一、光学显微镜技术light microscopy 普通复式光学显微镜技术 荧光显微镜技术 p53 激光共焦扫描显微镜技术 p53 相差显微镜 p51 微分干涉显微镜 p51 录像增差显微镜技术 倒置显微镜 暗视野显微镜 显微镜发展趋势 电子显微镜的基本知识 主要电镜制样技术 扫描电镜 三、扫描遂道显微镜  （ scanning tunneling microscope ，STM） ?原理：量子力学中的隧道效应，原子间作用力、磁力、摩擦力等 ?装置：扫描的压电陶瓷，逼近装置，电子学反馈控制系统和数据 采集、处理、显示系统。 ?特点：1、可对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，分辨本领高 （侧分辨率为0.1～0.2nm，纵分辨率可达0.001nm） 2、可在真空、大气、液体等多种条件下进行非破坏性测量 3、可实时得到样品表面三维图象，可测量厚度信息 4、可连续成像，进行动态观察 ?用途：纳米生物学研究领域中的重要工具 荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy） 原理与应用 ?直接荧光标记技术 ?间接免疫荧光标记技术 ?在光镜水平用于观察能激发出荧光的结构。免疫荧光观察、疾病诊断、特异蛋白质等生物大分子的定性定位：如绿色荧光蛋白(GFP)的应用 激光共焦扫描显微镜技术（Laser Confocal Microscopy） ? 原理 ? 应用： ?微分干涉显微镜 （differential-interference microscope） 偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于研究活细胞中较大的细胞器 ?录像增差显微镜技术 （video-enhance microscopy） 计算机辅助的微分干涉显微镜可在高分辨率下 研究活细胞中的颗粒及细胞器的运动 电镜与光镜光路图比较 电子显微镜的基本构造 主要电镜制样技术 ?超薄切片技术 用于电镜观察的样本制备示意图 ?负染色技术（Negative staining）重金属盐对铺展在载网上样品染色，干燥后衬托出样品的精细结构 ?金属投影 ?冰冻蚀刻技术（Freeze etching） （技术示意图） 冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。 快速冷冻深度蚀刻技术（quick freeze deep etching） ?电镜三维重构技术 ?整装细胞电镜技术 是观察细胞骨架的处理技术。 扫描电镜（Scanning electron microscope，SEM） ?原理与应用： ?电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，探测器收集二次电子成象。 ?特点： ?引起样品变形的表面张力问题--- CO 2临界点干燥法 ?核酸大分子制样技术 ? 电镜显微放射自显影 ? 电镜整装细胞制片技术 激光作扫描光源 扫描焦平面上样品，得样品切面像 载物台上微量步进马达使载物台 上下移动,改变焦平面 得不同层次的切面图像 计算机图像三维重组获样品立体图像 原理：扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产生彼此间相互作用力，电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，从而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。 样品制备简单 * 取材、清洗 * 固定 * 干燥 * 镀膜 配 法 甲液：0.2M磷酸二氢钠溶液 NaH2PO4·2H2O 31.2g 蒸馏水加至 100ml 乙液：0.2M磷酸氢二钠溶液 Na2HPO4·2H2O 53.61g 或 ( Na