实验三-离心技术及物质代谢实验-xuxia.pptVIP

实验内容 离心技术 邻甲苯胺法测血糖含量 糖酵解中间产物磷酸丙糖的鉴定 酶法测定血浆胆固醇（下午） 二、胰岛素对血糖含量的影响及测定 实验目的： 通过实验方法证实胰岛素对血糖含量的降低作用，即检测家兔注射胰岛素前后血糖浓度的改变. 掌握邻甲苯胺法测定血糖浓度。 实验原理： 1.胰岛素降血糖的机理： 1)促进肌肉、脂肪组织对葡萄糖的通透性，促进葡萄糖进入这些细胞； 2)糖原合成↑,糖原分解↓； 3)糖有氧氧化↑； 4)磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶合成↓→糖异生↓； 5)激素敏感性脂肪酶↓→脂肪动员↓。 2.血糖含量的测定： 1.??1）取试管四支，按下表操作　 2）混匀，置沸水浴中加热10分钟，取出立即置冷水中冷却． 3）用630nm波长，以空白管校正吸光度为0，分别测定各管吸光度值． 4）计算： 目前国内医院多采用葡萄糖氧化酶法和邻甲苯胺法测定血糖。 注意问题 胆固醇含量测定：4个组做空白和标准管，样品管每个组都做。测吸光度值时把空白管和标准管放入分光光度计，只换样品液即可。 实验注意事项： 试管、移液管洗干净； 加入的试剂正确； 混匀； 成腙反应前，溶液必须先碱化并在室温放置10min，目的是使磷酸丙糖中的磷酸基水解脱去，生成的颜色比较稳定。 血清胆固醇测定（酶法） 【实验目的】 1.了解胆固醇氧化酶法测定血清胆固醇的原理。 2.掌握血清胆固醇测定的临床意义。 血清中总胆固醇包括胆固醇酯(CE, 70%)和游离型胆固醇(FC, 30%)。胆固醇酯酶（CEH）先将胆固醇酯水解为胆固醇和游离脂肪酸（FFA），胆固醇在胆固醇氧化酶（COD）的作用下氧化生成Δ-4-胆甾烯酮和过氧化氢。后者经过氧化物酶（POD）催化与4-氨基安替比林（4-AAP）和酚反应，生成红色的醌亚胺，其颜色深浅与胆固醇的含量呈正比，在500 nm波长处测定吸光度，与标准管比较可计算出血清胆固醇的含量。反应式如下： 【实验原理】 1.标本：不溶血的血清或血浆标本。血浆用肝素钠、 EDTA抗凝，不可用草酸盐、氟化物。 2.取试管3支，编号，按下表操作。 【实验方法】 加入物（ul） 测定管 标准管 空白管 血清 10 - - 胆固醇标准液 - 10 - 蒸馏水 - - 10 酶应用液 1000 1000 1000 3.混匀后，37℃水浴保温15分钟，在500 nm波长处比 色，以空白管调零，读取各管吸光度。 【计算】 A标本 CHO（mmol/L）= ———— × 标准液浓度 A标准 【标准液】 胆固醇 5.17 mmol/L（200mg/dL） 【正常参考范围】 3.10～5.70mmol/L * * * * * * * * * * * * 特别是在生物化学和分子生物学研究领域，，每个生物化学和分子生物学实验室都要配置各种类型的离心机 细胞器、生物大分子的沉淀等 实验三 离心技术及物质代谢实验 徐清清 定义：离心技术（Centrifuge technology）是利用物体高速旋转时产生强大的离心力，使置于旋转体中的悬浮颗粒发生沉降或漂浮，从而使某些颗粒达到浓缩或与其他颗粒分离之目的。 用途：离心是蛋白质、酶、核酸及细胞亚组分分离的最常用的方法之一。 离心技术 第一节 离心技术的原理 当一个粒子在高速旋 转下会受到离心力F作用， 其大小为： 。 m：沉降粒子的有效质量 r：粒子的旋转半径，单位cm ω：粒子旋转的角速度 离心机转速的表示方法： 1.每分钟转数 Revolutions Per Minute (rpm) 2.相对离心力 Relative Centrifugal Force (RCF) RCF 表示实际离心力相当于地球引力的倍数，常用数字乘“g”来表示。 980 2 r w RCF = = F mg RCF = 1.119×10-5×(rpm)2r rpm：每分钟转数，单位r/min g：重力加速度，约等于980cm/s2 ω：单位弧度/秒 （rad/s） 相对离心力： 沉降颗粒在离心管中所处位置也不同，则所受离心力不同。因此在描述超速离心条件时，通常用RCF代替rpm，因为它可以真实地反映颗粒在离心管内不同位置的离心力及其动态变化。 F=m*ω2*r 定义：沉降速度与离心力加速度的比值，即单位离心场中颗粒的沉降速度，单位为“S”。S=V/ω2r 人们规定1S=1×10-13 秒 S=V (D-D’)