蛋白质的复性课件解析.pptVIP

展 望 研究蛋白质变性复性机理，开发新的变性复性原理和技术，解决目前的技术关键。 完善现有技术，实现现有技术的实用化和规模化。 根据现有技术原理，扩大应用范围。 开发实用的设备 预防包含体形成的方法 1. 形成分子伴侣 2. 通过改变、优化培养条件增加表达产物的可溶性. 为了使外源蛋白在E.coli细胞中可溶性，人们在培养 条件的优化方面进行了多方面的探索。 3．通过基因突变技术，在蛋白分子中产生氨基酸取代，来增加重组蛋白的可溶性。 - + EOF 毛细管电泳 电泳+电渗流 0 tm (min) 8 - + EOF 毛细管胶束电动色谱 蛋白质的复性 包含体 什么是包含体？ 包含体是指外源基因在宿主细胞中表达时，表达的蛋白质不仅不能分泌到细胞外，反而在细胞内聚集成没有生物活性的直径约0.1-3.0μm的固体颗粒。这些基因表达产物的一级结构(即氨基酸序列)虽然正确，但其立体结构是错误的。 包含体的形成 包含体的形成比较复杂，有些机理还不清楚； 一般认为包含体的形成是蛋白质过量表达的结果。包含体的形成是部分折叠的中间态之间疏水性相互作用的结果，主要原因是蛋白质本身具有易于聚集沉淀的性质，或表达产物周围的物理环境（如温度、离子组成）不适或缺少某些折叠辅助因子（如分子伴侣）的作用。其形成是不可预测的。 包含体的性质 高密度的蛋白质聚集体 主要为基因表达产物 包含体内的表达产物具有部分二级结构 包含体对蛋白酶解不敏感 以包含体形式表达重组蛋白质具有优势：书386页 蛋白质复性 1.包含体的纯化 2.包含体的溶解 3.包含体的复性 包含体的纯化 --- 采用密度梯度离心技术则可得到纯度较高的包含体。如果得到的包含体含有较多的杂质，可用螯合剂、低浓度变性剂或表面活性剂（TritonX-100）的溶液进行洗涤，使污染的膜蛋白等杂质溶解，得到含杂质较少的包含体。 包含体的溶解 利用高浓度的强变性剂溶解包含体，如6-8mol/L盐酸胍或8mol/L尿素，也可利用硫氰酸盐或表面活性剂。 对于含有二硫键的蛋白质，还需加入还原剂解离错配的二硫键 螯合剂清除重金属离子 蛋白质复性 稀释复性 分子伴侣辅助复性 反胶束复性 固相辅助复性 稀释复性： 直接稀释复性 透析复性 流加复性 蛋白质复性的影响因素 浓度 增加蛋白质的浓度有利于聚集的进行 温度 蛋白质的复性一般在室温下进行，温度过高（＞40℃） 蛋白质的聚集将十分严重 pH值 通常复性在弱碱性条件下（pH8）进行，但要注意避免 与蛋白的pI值相近 折叠促进剂 （辅助因子） L-Arg, PEG, 去污剂, 尿素和盐酸胍 包含体产物分离工艺（牛生长激素分离提取） 分子伴侣辅助复性 分子伴侣 ★1978年Laskey等发现； ★1987年Ellis提出普遍意义分子伴侣； ★1993年Ellis对分子伴侣做了更为确切的定义：即分子伴侣是一类相互之间有关系的蛋白，它们的功能是帮助其他含多肽结构的物质在体内进行正确的非共价的组装，并且不是组装完成的结构在发挥其正常的生物功能时的组成部分。 分子伴侣在蛋白质正确折叠中的关键作用 ★阻碍集聚 ★折叠互补功能 ★促进错误折叠降解 反胶团中的蛋白质复性 利用反胶团溶解变性蛋白质，可将变性蛋白质分子彼此分隔开来，阻止分子间的相互作用，提高复性收率。 存在问题：变性剂抑制蛋白质在反胶团相的溶解，故萃取率很低。